噬菌体展示技术原理

  一、引言
 

  噬菌体展示技术（Phagedisplaytechniques，PDT）是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物技术，自1985年被首次提出以来，已经被广泛应用于生命科学领域。该技术将基因型和表型有机地联系起来，可以获得容纳几万甚至几亿个的不同肽或蛋白质的表达文库，并已应用于重组肽库的亲和筛选、确定单克隆抗体的抗原表位、选择酶作用底物以及筛选克隆的全套抗体。噬菌体展示技术是后基因组工程的有力工具。噬菌体展示技术的进一步发展，必将为生命科学及相关学科的发展带来深远的影响。
 

  二、原理
 

  噬菌体属于单链DNA病毒，包括f1、fd和M13三类。噬菌体DNA在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，而且可分泌出大量成熟的噬菌体颗粒。噬菌体的单链DNA长约70bp，不同类型噬菌体的一级结构极为相似，基因组编码1种蛋白质，其中5种为结构蛋白（表6-1），与噬菌体展示密切相关的是二种不同的结构蛋白pⅢ和pⅧ。噬菌体单链DNA被包裹在270耀30个主要衣壳蛋白pⅢ分子组成的管状结构中，另外次要衣壳蛋白pⅢ通过与大肠杆菌的F菌毛结合而引起感染，是噬菌体感染宿主所必需的。pⅢ前体由73个氨基酸残基组成，其中信号肽为23个氨基酸残基，根据构成外壳的功能可分为四个区：6-24氨基酸残基区域占据噬菌体表面的大部分；25耀35氨基酸残基区域具有高度疏水性；C端（35耀50氨基酸残基区域）与DNA相结合，构成完整的内壁；N端（1耀5氨基酸残基区域）为可活动的、外露在噬菌体表面的肽段，是插入外源基因的最佳位置。pⅧ前体由424个氨基酸残基组成，形成3耀5个拷贝，位于噬菌体的尾部，也由4个功能区组成：信号肽区（18个氨基酸残基）引导pⅧ至细菌胞间质，在pⅧ分泌后被细菌蛋白酶水解；其后的穿膜区与噬菌体的侵入有关；受体结合区负责结合F菌毛；而C端的疏水区组装前黏附在细菌内膜上，组装后这段氨基酸序列锚在噬菌体外壳上。穿膜区是最外露的区域，因而成为插入外源基因的理想位置（Coreyetal，193；Folgorietal，194）。
 

  噬菌体展示技术以构建的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法将表达有特异肽或蛋白质的噬菌体富集（Doweretal，198；Marksetal，192；PasqualiniandRuoslahti，1996）。
 

  噬菌体展示技术的建立包括以下3个过程：①外源基因的N端插入。在pⅢ和pⅧ衣壳蛋白的N端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响和干扰噬菌体的生活周期，同时保持的外源基因天然构象也能被相应的抗体或受体所识别（ParmleyandSmith，1998）。②筛选。利用固定与固相支持物的靶分子，采用适当的淘洗（paning）方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体（Pas-qualiniandRuoslahti，1996）。③测序及推导。外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。
 

  该技术实现了基因型和表型的转换。噬菌体结构蛋白pⅢ和pⅧ均可作为载体来展示外源多肽或蛋白质，在基因操作上它们基本相同。在信号肽与成熟蛋白质编码区之间有单一的克隆位点便于插入，插入的外源多肽或蛋白质以融合的形式表达出来并分泌到胞间质内，当宿主蛋白酶切除信号肽后，融合蛋白组装成熟，呈现在病毒粒子的表面，新的N端位置正是外源蛋白或多肽的插入点。与pⅢ基因融合时拷贝数低（不超过5个），这可以减少多价结合，利于选择高亲和力的配体分子，还容许插入大的片段（JacobsonandFrykberg195）。与pⅧ基因融合时，拷贝数高（2700个），当将属于多肽的表位用作免疫源时可产生良好的免疫应答，具有反应优势，故在疫苗开发上具有潜在的应用价值。亲和筛选可用直接法或间接法。直接法是将蛋白质分子偶联到固相支持物上，文库噬菌体与固相支持物温育，洗去未结合的噬菌体，即获得亲和噬菌体；间接法是将生物素标记的蛋白质分子与文库噬菌体温育后铺在结合有链亲和素的平皿上，洗去未结合的噬菌体，保留的就是结合状态的噬菌体，再洗脱结合的噬菌体，用这部分噬菌体感染细菌，扩增噬菌体，开始新一轮的筛选，通过几次这样的亲和纯化反应，就能选择性地富集并特异性扩增结合这种蛋白质或DNA分子的噬菌体。筛选出的噬菌体的结合特性可以进一步验证并从DNA序列推导出来，分析各个克隆间编码短肽的一致序列，以确证筛选的特异性。最后，利用化学合成含一致序列的氨基酸短肽，研究它们的亲和特性并推测可能配体的生物学活性和结合或游离状态的结构特点（Wrightonetal.1996）。
 

  目前，噬菌体展示文库的建立已经比较成熟，可直接从生物试剂公司（如Biolab，Spring等）购买后进行筛选，避免繁琐的建库过程。