细菌内毒素检测技术

依据2010年版《中国药典》，本法适用于注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检测项目时进行。

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鲎试剂法检测内毒素的灵敏度为0.01μg/ml，比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，目前尚不能完全代替家兔法。

一、检测原理及方法

（一）检测原理

鲎是一种海洋的无脊椎动物，出现于古生代的泥盆纪，距今约有3亿年，血液呈蓝色。鲎试剂是鲎的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品，因含有能被微量细菌内毒素激活的凝固酶原和凝固蛋白原。在适宜的条件下，细菌内毒素激活鲎试剂中的凝固酶原转化成有活性的凝固酶，在其作用下，可溶性的凝固蛋白原变成凝固蛋白，进而交联为凝胶。此试验敏感性极高，可检出0.01ng/ml的内毒素。

（二）检测方法

系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。其中包括：凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。

1.凝胶法 系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。

2.浊度法 用于内毒素的定量检测，系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

3.显色基质法 系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或检测色度增长速度的方法。

供试品检测时，可使用上述任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。在我国2000年版《中国药典》细菌内毒素检测法应用指导原则正式被列入，定量法在我国得到肯定、应用和推广。2005年版将2000年版的指导原则合并入检测法中，正式收载光度测定法作为细菌内毒素定量检测法。定量检测法的不断完善也是我国今后要努力发展的方向。

二、材料及用具

1.鲎试剂

2.细菌内毒素国家标准品（RSE） 系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

3.细菌内毒素工作标准品（CSE） 系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

4.细菌内毒素检测用水（BET） 内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.05EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。图10-2 细菌内毒素分析仪。

5.分析天平（精度为0.1mg以下） 用于称量供试品。

6.电热恒温干燥箱（温度应能达到250℃）用于去除外源性内毒素。

7.恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）

8.漩涡混合器

9.细菌内毒素光度测定仪器（细菌内毒素分析仪）（图10-2）

10.其他 试管架、镊子、消毒棉球、称量瓶（30mm×60mm）、刻度吸管（1ml、2ml、5ml、10ml、15ml）、各种试管、中号金属饭盒、加样器等（目前已有多种无热原的一次性用品）。

三、内毒素限值及最大有效稀释倍数（MVD）的确定1.内毒素限值 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。内毒素限值以EU/ml、EU/mg、EU/U等表示。药典中或国家标准有规定的，按供试品规定限值。尚无内毒素限值标准规定的品种，根据供试品具体情况按药典规定计算。对于美国、欧洲或日本药典已收载并已建立细菌内毒素检测法的品种，可参考国外药典规定的限值，与按公式计算出的数值比较，以严格者为该品种的限值。如果使用的是国外药典的限值，应以最新版本药典为准。

2.最大有效稀释倍数（MVD） 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。根据鲎试剂的灵敏度范围，用以下公式来确定MVD：

MVD=cL/λ

L：为供试品的细菌内毒素限值；

C：为供试品溶液的浓度；

λ：为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。

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当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml；当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L。