蛋白质亚细胞定位实验步骤

1.将处理好的盖玻片放在12孔板底部

如果细胞贴壁不牢（如HEK293）或者是半贴壁细胞（如 PC12），可以用细胞刮子将鼠尾胶原均匀地涂抹在玻片上包被。也可使用多聚赖氨酸，但是效果不如鼠尾胶原。事实上大部分贴壁的细胞都不用进行包被。如果在操作中发现细胞脱片严重，则可考虑进行包被来提高细胞贴壁能力。

2.将与培养基混匀后的细胞悬液加入孔中

这一步混匀非常重要，如果不匀，一般细胞都会聚集在玻片中央区域，会对形态观察产生不利影响。分细胞的时候要注意进行形态观察的时候应该将细胞分得相对稀一些，密集的细胞不利于形态观察。每孔细胞的数量根据细胞大小的不同应该作出相应调整，一般10⁴细胞即可。

3.待24h后固定

用 PBS将细胞洗3遍，每遍5min［如果细胞贴壁不牢（如HEK293）或者是半贴壁细胞（如 PC12），应该将12孔板倾斜，将PBS从低处缓缓加入，再平放，以免使细胞脱片］。然后加入4%多聚甲醛固定液（如果细胞贴壁不牢，必须以同样的轻柔方式），室温固定10--15min。如果细胞贴壁不牢（如HEK293PC12），应该将12孔板倾斜，从低处缓缓加入，再平放，以免使细胞脱片。过长时间的固定会影响蛋白的免疫原性，对于细胞来说10耀15min的固定已经足够。

4.用PBS将细胞洗3遍，每遍5min

方法同前。

5.细胞透化

室温下，0.5% TritonX10/PBS透化处理10min。时间过长或者强度过高的透化有可能会破坏细胞的膜结构，对于细胞来说我们提供的透化已经足够用于全细胞染色。

6.用4℃预冷的PBS将细胞洗3遍，每遍5min。

7.封闭

以3% BSA/PBS封闭，37℃，30min或4℃ 过夜。这里我们推荐37℃，30min。此步主要用于封闭非特异蛋白质结合位点。也可以使用正常的鼠、兔、羊等与抗体相对应的正常血清作为封闭剂，使用的时候要进行适当的稀释。

8.PBS将细胞洗1遍

方法同前。

事实上也可以不洗。

9.一抗孵育

在每孔中加入50μl以PBS按一定的稀释度稀释的一抗。（一般参考抗体说明书上推荐的浓度，当然也可以根据自己实验的不同来调整，如果是自己制备的抗体，要做梯度稀释来选取最佳稀释度；进行双免疫荧光分析则可以同时加入两种一抗。）在盖玻片上盖一层封口膜（15ml离心管在封口膜上扣下的印迹可以作为裁剪封口膜的边界），放于湿盒中，37℃30min或者4℃过夜。

4℃过夜的一抗孵育有利于抗体和抗原蛋白充分结合，这里推荐大家使用4℃过夜作为一抗孵育的实验条件。当然也可以使用多加抗体稀释液的方法，但是这样比较浪费抗体。事实上4℃过夜孵育用过的抗体还可以被回收使用，这种方法在商品化抗体价格高昂的情况下还是有一定实用价值的，不过正式实验中不推荐。

10.用4℃预冷的PBS将细胞洗3遍，每遍5min，洗去多余的一抗

方法同前。

11.二抗孵育

在孔中加入50μl以PBS按1∶50稀释的荧光素标记的二抗（选用中杉抗体作为参考，如果进行双免疫荧光分析则同时加入两种二抗），在盖玻片上盖一层封口膜，湿盒中，37℃30min（推荐）或者4℃过夜。

事实上，一般来说二抗还可以稀释以取得更加特异的染色效果。

12.用4℃预冷的PBS将细胞洗3遍，每遍5min

方法同前。

13.双蒸水将细胞洗3遍，每遍5min。

14.如果需要染核，在细胞上滴加DAPI工作液；如果不需要，可直接进行乙醇漂洗。如果细胞贴壁不牢（如HEK293PC12），应该将12孔板倾斜，从低处缓缓加入，再平放，以免使细胞脱片。

15.甲醇漂洗。

16.乙醇漂洗。

17.将玻片用针头在乙醇中撬起一侧，用镊子将玻片取出放在滤纸上晾干。

18.封片：取8μl封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片。封片剂不能多加，否则玻片会滑动。

19.待封片剂均匀分布于盖玻片下，即可周围用指甲油封住（指甲油也只能加适量）。

为了取得最佳的染色效果，有时候有必要将一抗、二抗的进行梯度稀释，再用来对细胞进行免疫荧光染色。例如，一抗：1∶50，1∶10，1∶20，1∶40；二抗：1∶10，1∶20。

通过这样的方法得到的染色片在倒置荧光显微镜下信号清晰明亮、本底低、对比明显，能够满足激光共聚焦显微镜观察的要求。因为激光共聚焦显微镜逐点扫描特定焦平面各点，所以在目镜下弱的信号一般都很难被采集到。

除此之外，由于在这种方法中，很有可能我们使用的一抗是多克隆抗体或者抗血清，所以有时候会有比较高的本底。所以还可以在一抗、二抗染色液以及洗一抗、二抗所用的PBS中添加一定量的吐温-20洗涤剂，以去除非特异性的蛋白结合，达到最佳效果。一般使用起始浓度0.02%即可，最适工作浓度在具体实验中同样需要进行摸索。另外4℃过夜的染色条件比较容易产生非特异性染色，所以如果发现背景深，可以使用37℃，30min染色来进行改善。还有可能遇到的情况就是观察采集不到阳性信号。首先我们要确认目的蛋白（内源性或者过表达的标签融合蛋白）是否表达了，其次一抗的适用性也有待检验，因为有的抗体只能识别变性后的蛋白质，而对于固定后的蛋白质不能识别。二抗一般使用商品化的，如果保管合适的话，很少出现问题。如果抗体与抗原结合能力弱，可以适当降低洗涤强度，PBS里不添加洗涤剂。

如果使用组织切片来进行免疫荧光染色，我们推荐使用冷冻切片，丙酮固定。因为这样的固定一般不会破坏免疫原性，能够直接进行下一步的操作。而如果使用多聚甲醛固定，石蜡包埋的方法，需要对组织块进行长时间的多聚甲醛固定，很容易破坏免疫原性，有时候必须进行抗原修复，所需要的抗原修复液可以从公司订购。具体的操作方式可以参照免疫组化的相应操作来进行。需要注意的是切片最好薄一些，以便观察。这里主要是用染色缸来作为容器，但是使用抗体染色的时候，也可以使用滴加抗体稀释液，再用封口膜覆盖的方法，这样比较节约，有的公司也提供了专用的覆盖用薄膜，有条件的也可以选购。