动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法

本节介绍的液相色谱串联质谱检测法是以GB／T 2131l 2007《动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱／串联质谱法》为基础。

(1)方法提要

样品经0．125mol／L。HCL提取，样品中的AOZ、SEM、AHD、AMOZ残留物与衍生化试剂2一硝基苯甲醛(NBA)反应，分别生成NP AOZ、NP—SEM、NPAHD、NP AMOZ，衍生物经乙酸乙酯萃取，萃取液用氮气流挥干，残渣用乙腈乙酸混合物溶解后用正己烷脱脂，用液相色谱一质谱／质谱仪测定．内标法峰面积定量。

AOZ、SEM、AHD、AMOZ测定低限均为0.5ug／kg。

(2)样品处理

①提取称取经肉类组织粉碎机粉碎的试样5g(精确至0．01g)于5omL离心管中，加入150uL内标}昆合工作液(20ng／mL)，lOmL 0．125mol／L盐酸溶液在匀浆机上以14000r／min速度匀浆30s。用lOmL 0．1 25mol／L盐酸溶液洗涤匀浆刀．合并提取液。

②水解与衍生化离心管中加入500uL新鲜配制的2-硝基苯甲醛(NBA)衍生试剂(5omm01／L二甲亚砜)，旋涡振荡器上混旋30s，放在37℃摇床中反应14～l 6h(放置过夜)。反应完毕后取出离心管冷却至室温。衍生化过程要注意避光操作。

③净化离心管在4000r／min下离心10min，上清液转入另一离心管中，残渣弃去。将上清液用O．125mol/L盐酸溶液定容至25mL，旋涡振荡器上混旋30s．将定容好的溶液取10mL于另一离心管中，加入5mL 0．1mOl／L K₂HPO₄溶液．0．6mL 1mol／L KOH溶液．摇匀，调节pH值在7～7．5，30s后重复测定一次pH值，如pH值有变动．重新调节pH值。离心管中加入8n1L乙酸乙酯，振摇2min．以4000r／min速度离心5min，上层清液移至吹氮浓缩仪的吹氮管中，重复用8mL乙酸乙酯抽提一次，离心后的上清液合并至吹氮浓缩仪的吹氮管中，在50℃下用氮气将溶剂挥干，残渣用2．0mL乙腈0．1％乙酸水溶液(1+9，体积比)溶解．

旋涡振荡器上混旋30s，加入3mL正己烷，旋涡振荡器上混旋30s，弃去上层正己烷溶液，加入3mI。正己烷重复脱脂，下层样品溶液在1 2000r／min下离心10min后经O．2um滤膜过滤后上机测定。操作过程要注意避光。

(3)测定

①仪器条件

a．液相色谱条件 色谱柱：NUCLEODUR 100一3C₁₈ ec柱，100mm×2．0mm(1．d．)，粒度5um。柱温：35℃。流动相：乙腈+O．1％乙酸水溶液。梯度洗脱模式，梯度洗脱表见表3—9，流速O．2mL／min。进样量：10uL。

b．质谱条件。离子源为电喷雾离子源(ESI)，离子源温度650℃，正离子模式检测，电离电压4500v。质谱仪的雾化气、辅助加热气、碰撞气均为高纯气体。参考质谱参数见表3-10、表3一11(仪器型号为APl4000QTRAP)。

①定量离子对。

②工作曲线 按表3—1 2分别准确吸取一定量的浓度为20ng／mL的AOZ、SEM、AHD、AMOZ标准混合工作液至50mL离心管中，加入60uL内标混合工作液(20ng／mL)、15mL O．125mol／L盐酸溶液，摇匀．按(2)步骤②处理，样品净化时加入5mL O．1mOl／L K₂HP0₄溶液，1．6mL 1mol／L KOH溶液，其余同(2)步骤①处理方法。

③样品测定按(3)所述的仪器条件，按标准溶液、试剂空白、样品空白、样品加标、样品空白、待测样品、样品加标的进样次序进样。采用内标法峰面积定量。

以标准溶液分析物峰面积与标准溶液内标物峰面积的比值对标准溶液分析物浓度与标准溶液内标物溶度的比值作线性回归曲线。将样液中分析物峰面积与样液中内标物峰面积的比值和样液中内标浓度代人线性回归方程得到样液中分析物浓度。

按内标法计算公式计算样品中分析物含量。网3—7是4种硝基呋喃类药物代谢物的萃取离子流图[仪器条件见(3)节]。

当样品中检出硝基呋喃类药物残留物时，除考虑保留时间是否相近，还应比较样品中待确证的残留物的两个特征离子的相对丰度比与同批检测的浓度接近的标准溶液中对应的分析物的两个特征离子的相对丰度比是否一致，相对偏差不超过第6章表6—7规定的范围。网3—8是一个检出呋喃唑酮代谢物残留的实例，样品及同批检测的标准溶液的离子比(峰高比)列于表3—1 3。

(4)关键控制点及注意事项

①建议衍生化试剂2-NBA溶液现用现配，以确保衍生化试剂的有效。

②衍生化过程要注意避光操作．整个净化操作过程注意避免强光照射。

③步骤(2)中调节样液pH步骤，对提取效率有重大影响，对于经常检测的样品基质．可通过实验摸索缩小pH调节范围，减少二次测定pH的间歇时间．加快提取步骤的速度。

④乙酸乙酯提取步骤对回收率有直接影响，须严格按照标准方法要求的振荡频率和振荡时间进行，以确保提取效果。