转基因成分快速检测方法的确认

转基因成分快速检测方法的确认

1．ISO 24276、GB／T 19495．1中的相关规定

ISO24276中规定了食品中转基因成分定性、定量检测方法的一般要求，GB／T 19495．1参照ISO 24276也规定了检测方法的通用要求。

实验室制定的方法或被实验室选定的其他方法须经过有效验证方能采用。

定性PCR检测方法有常规PCR、实时荧光PCR和基因芯片检测方法。定性检测对象包括转基因的启动子、终止子、抗性筛选基因、目的基因等外冈基因，检测时应设阳性目标DNA对照、阴性目标DNA对照，试剂空白对照和提取空白对照，必要时还必须设立PCR抑制剂对照。同时应检测物种内源基因。定性方法的特异性必须通过有效实验加以证明，阳性误差率应小于等于5％。定性方法的检测低限应符合分析物的最低含量水平即至少有95％的灵敏度(阴性误差率应小于等于5％)，实际的检测低限是指目标DNA能被检测到的最低含量，它与测试样品、模板DNA质量和(或)数量以及方法的绝对低限有关。

转基因成分的定量PCR检测方法视情况选用外源基因的其中一种进行，并使用符合采用检测标准中规定的转基因阳性标准物质或阳性标准分子。检测时须设立设阳性DNA对照、阴性DNA对照，试剂空白对照和提取空白对照．必要时还必须设立PCR抑制剂对照。定量方法的检测低限应符合分析物最低含量水平为25％或者更少。定量方法的实际检测低限是指目标DNA能够被可靠定量的最低含量，它与测试样品、模板DNA质量和(或)数量以及方法的绝对低限有关。

以蛋白质为基础的检测方法是检测转入外源基因的表达蛋白，适用于抗原性未被破坏的转基因产品，但标准中未规定对此方法的具体要求。

2．CAC／GL 74—2010中的相关规定

CAC／GL 74—2010《Guidelines on performance criteria and validation of methods for detection，identificatlon and quantification of specific DNA sequences and specific proteins in foods))中规定了食品中特定DNA序列检测和特定蛋白质的检测、鉴定和定量的方法的执行标准和确认指南。方法的确认包括两个阶段，一是除了复现性外的室内验证的所有参数，二是协同试验，主要是在实验室间的方法转移使用上给出重复性和复现性的测量以及细节的信息。

(1)定量PCR方法的确认

定量PCR方法的确认参数包括：适用性、动力学范围一定量的范围、LOD检测限和LOQ定量限、真实性、精密度、灵敏度和稳健性等。定量PCR的相对重复性标准偏差重复性标准偏差(RSDr)在方法的整个动力学范围应该小于25％，相对再现性标准偏差(RSDR)在方法的主要动力学范围应该小于35％。稳健性是对分析步骤中保持不受方法参数中小的但是有准备的变化影响的能力的一种检测，并且提供了方法在正常使用中的可靠性的指示。这种变化的例子包括：反应体积、退火的温度和／或其他的相关变化．这些实验应该至少进行三次，在复现性的试验中，一个方法关于这些小变化的响应与在正常条件下获得响应相比不能有超过±35％的偏差。对任何一个方法来说，方法的正确度应该通过与使用有已知值和指定值的参考物质的分析来比较结果来确定的。PCR的正确度值正负25％．都是可以接受的。

(2)定性PCR方法的确认

定性PCR方法的确认参数包括：a)假阳性率，这是一个已知阴性检测样品被方法分类成为阳性的可能性。为方便，这个比率可以表达为百分比如下：％假阳性结果等于100乘以被错误分类的已知阴性样品的数目除以已知阴性样品的总数。b)假阴性率，这是一个已知阳性检测样品被方法分类成为阴性的可能性。为方便，这个比率可以表达为百分比如下：％假阴性结果等于100乘以被错误分类的已知阳性样品的数目除以已知阳性样品的总数。(c)稳健性。

(3)定量蛋白质检测方法的确认

定量蛋白质检测方法确认参数包括精确度／正确度、选择性、提取效率、灵敏度、定量范围、精密度、稳健性、应用性和实用性。精确度可以通过测定加标样品中分析物的回收率来说明，并且可以用通过定量范围内多个水平的平均回收率来给出报告。检测内精度说明的是检测内发生的变化程度，可以通过标准曲线上多种浓度的重复检测和不同日问所进行的独立检测的标准吸收值所得出集合变异(RSD_r)之间的变化的确定来评估的。检测间精度说明的是独立检测之间出现的变化程度，可以通过在每个微板上质量控制样品的分析来测定。检测间精度可以按时间的变化进行评估并且可以表达为％变异系数。在方法的整个动力学范围过程中相对重复标准偏差(RSD_r)应该小等于25％。在目标浓度和主要的动力学范围相对再现性标准偏差应该小于35％，特别是定量限，它可以更高一些。理想的源于单个的样品提取的多个稀释所得到的调整过的结果的变异系数应该小于有等于20％。

(4)定性蛋白质检测方法的确认

定性蛋白质检测方法确认参数包括灵敏度、选择性、适用性、检测限、稳健性、基质效应、钩状效应。

转基因成分快速检测结果的确证

目前，现有的转基因成分快速检测方法主要包括外源基因(序列)的定性、定量检测方法，以及外源蛋白质的定性、定量检测方法。其中一些方法的阳性检测结果不需要经过确证就可以出检出某种转基因成分的报告，如实时荧光PCR、基因芯片、分子杂交等。而有一些方法的阳性检测结果需要经过确证才可以出检出某种转基因成分的报告，如普通PCR、PCR—DHPLC、LAMP等方法，确证的方法包括：实时荧光PCR法、目标片段的序列测定、PCR产物的酶切结果、分子杂交等，具体的可以参阅以上已发布的标准。