培养基的无菌检验

1．过滤

液体培养基必须绝对澄清．琼脂培养基也应透明无显著沉淀，因此，需要采用过滤或其他澄清方法以达到此项要求。先将过滤分装装置安装好。如果是液体培养基可用滤纸过滤法。滤纸应折叠成折扇或漏斗形。以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。如果是固体或半固体培养基．则需在漏斗中放多层(4层)纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤，使培养基清澈透明，以利于某些实验结果的观察。一般无特殊要求，此步可省略。新制肉、肝、血和土豆等浸液时．则须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过滤不能达到澄清要求，则需用蛋清澄清法，即将冷却至55～60℃的培养基放人大的三角瓶内．装入量不得超过烧瓶容量的1/2．每1000mL培养基加入1～2个鸡蛋的蛋清，强力振摇3～min．置高压蒸汽灭菌器中,121℃加热20min，取出趁热用绒布过滤即可。

2．分装

培养基的分装应按使用目的和要求分装于试管、三角瓶等适当容器内。分装量不得超过容器容量的2／3。容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵,其外还须用防水纸包扎(现试管一般多用螺旋盖)。分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2／3底层和1／3斜面的量为宜=分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应分装20mI，于小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，为测定该批培养基最终pH值之用：

3．包扎标记

分装完毕-在试管口或三角瓶口上塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞，棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，起到通气和过滤细菌的作用，并有2/3的长度塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落．从而过滤除去进入试管或三角瓶内的空气中的杂菌，并保证有良好的通气性能，减缓培养基水分的蒸发，有利于培养好气性微生物。有时也可用试管帽或塑料塞、硅胶试管塞代替棉塞。

包扎时，对于中试管可每7～1 5支用线绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳扎紧，并用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别和姓名等。三角瓶加塞后，每只单独用牛皮纸包好，用线绳以活结形式扎紧，使用时容易解开．并用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别和姓名等。

4．灭菌

将上述包好的培养基放人高压蒸汽灭菌锅内，按各种培养基规定的灭菌时间和温度进行灭菌，以保证灭菌效果和不破坏培养基的营养成分。一般培养基可采用1 21℃高压蒸汽灭菌15min的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应暂存于冰箱中。琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，待其自然凝固，

5．斜面和平板培养基的制作

(1)摆斜面

将灭菌或熔化琼脂培养基的试管冷至55～60℃时(以防产生大量冷凝水)。将试管口端斜置于玻璃试管(或长木条)上，使之凝固成斜面．即为斜面培养基。斜面长度一般以不超过试管长度的1／2为宜。如制作半固体或固体高层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。

(2)倒平板

将灭菌的三角瓶琼脂培养基冷却至50℃左右，立刻倒平板。在酒精灯火焰旁，先左手持三角瓶，右手反转手掌用中指和无名指拔出棉塞(或不翻转手掌用小指和手掌拔出棉塞)，同时将三角瓶转换至右手．而后左手拿平皿，以大拇指和中指将皿盖打开一条稍大于瓶口的缝隙，至瓶口刚好伸入。三角瓶口经火焰烧灼后，倾人培养基约15mL(勿使瓶口靠在平皿壁上。以免沾染皿壁)，迅速盖好皿盖，置于桌上轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿底部，等待平板冷却凝固，需要5～10min。然后将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上，如图3．5所示：

注意：培养基要冷却至45℃左右．温度太低培养基将凝固，温度太高培养基很烫，而且倒了平板后皿盖上会产生大量水蒸气。培养基要一次性全部倒完，不能未倒完时就塞回棉塞，因为三角瓶口残留培养基会污染棉塞和培养基。

(二)培养基的无菌检验

为了检查培养基灭菌是否彻底．抽取制备好的培养基l～2管，放于37℃培养箱中培养，经24h培养无菌生长，可保存备用．

每批培养基制备好后．应该仔细检查一遍，液体培养基应基本澄清，固体培养基应无絮状物或沉淀，凝胶强度适宜，用接种针划线时以培养基不被划破为宜。如果发现培养基不凝固、水分浸出、色泽异常、棉塞被培养基沾染等，均应挑出弃去。

固体培养基分装后有时会出现不凝固的现象，有多种可能的原因：①培养基pH值没调对，偏酸；②琼脂质量有问题或琼脂添加浓度不够．或由于琼脂粉在培养基中没有充分溶化就分装导致局部浓度过低；③灭菌时间过长，或温度过高，破坏了琼脂的凝固。④培养基在凝固的过程中被摇晃．破坏了琼脂的结构，而使其不能凝固。

(三)培养基的存放

每批培养基均应附有该批培养基制备记录副页或明显标签。培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱内。平板和试管斜面凝固冷却后装入密封袋中，存放在暗处或放在4℃冰箱中的，最多存l周。普通的琼脂培养基可存放在三角瓶内，使用时重新溶化。能发生化学反应或含有不稳定成分的固体培养基不能批量制备及再次溶化使用。倾注的平板培养基不宜超过3d。

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