一次性筷子中溶血性链球菌检验操作规程

(1)简述本规程适用于一次性筷子中溶血性链球菌检验的测定．检验依据为《食品微生物学检验溶血性链球菌检验》(GB／T 4789．11-2003)。

(2)仪器

①恒温培养箱(30～35℃)、生化培养箱(23～28℃)、电热干燥箱(100～300℃)、蒸汽灭菌器(使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定)、电子天平。

②玻璃器皿：锥形瓶、培养皿、量简、试管及塞、吸管。玻璃器皿均于160℃干热灭菌2h或高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干备用。

(3)试液、稀释剂和试剂 灭菌生理盐水；草酸钾血浆；O．25％氯化钙。

(4)培养基

①葡萄糖肉浸液；②匹克氏肉汤；③血平板。

培养基制备注意事项如下。

a．采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基pH进行校验。

b．配制的培养基不应有沉淀。如有沉淀，应于熔化后趁热过滤，灭菌后使用。

c．培养基的分装量不得超过容器的2／3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。

d．培养基配制后应在2h内灭菌，避免细菌繁殖。

e．灭菌后的培养基应保存在2～25℃，防止被污染，可在3周内用毕；保存于密闭容器中，可在1年内使用，制备好的培养基放置时间不宜过长．以免水分散失及染菌。

f．宜采用水浴或微波炉加热熔化琼脂培养基，勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成分过度受热而破坏。已熔化的培养基应8h内一次用完，剩余培养基不宜再用。

(5)操作步骤

①样品处理取筷子5支，将筷子下端浸入装有200mL葡萄糖肉浸液的三角烧瓶中，充分振荡1mm，作为样品溶液。

②培养将上述样品溶液置于(36±1)℃培养24h。如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经(36±1)℃培养24h。取上述培养物接种血平板，置(36±1)℃培养24h，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落。在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色。并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。

③形态与染色本菌呈球形或卵圆形，直径O．5～1μm．链状排列，链长短不一，短者4～8个细胞组成，长者20～30个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中常呈短链，不形成芽孢，无鞭毛．不能运动。

④培养特性该菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基中生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长时管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色。半透明或不透明，表面光滑．有乳光，直径0．5～O．75mm。为圆形突起的细小菌落，乙型溶血链球菌周围有2～4mm界限分明、无色透明的溶血圈。

⑤链激酶试验致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶(即溶纤维蛋白酶)，此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原，使形成血浆蛋白酶．而后溶解纤维蛋白。

吸取草酸钾血浆0．2mL，加O．8mL灭菌生理盐水，混匀，再加入18～24h、(36±1)℃培养的链球菌培养物O．5mL及O．25％氯化钙0．25mL(如氯化钙已潮解，可适当加大至O．3％～0．35％)，振荡摇匀．置于(36±1)℃水浴中10min，血浆混合物自行凝固(凝固程度至试管倒置，内容物不流动)，然后观察凝同块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24h后不溶解即为阴性。

草酸钾人血浆配制：草酸钾0．01g放人灭菌小试管中，再加入5mL人血，混匀-吸取上清液即为草酸钾人血浆。

⑥杆菌肽敏感试验挑取乙型溶血性链球菌液，涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0．04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于(36±1)℃培养18～24h，如有抑菌带出现即为阳性，同时用已知阳性菌株作为对照。

(6)检验程序如图10—5所示。

(7)结果与报告

①结果判断：符合(5)一⑤、(5)一⑥，可判定为溶血性链球菌。

②结果报告：报告在样品中检出或未检出溶血性链球菌。

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