标准样品的定值

标准样品的定值是对标准物质特性量赋值的全过程。标准样品作为计量器具的一种，它能复现、保存和传递量值．保证在不同时间与空间量值的可比性与一致性。要做到这一点就必须保证标准样品的量值具有溯源性，即标准样品的量值能通过连续的比较链以给定的不确定度与国家的或国际的基准联系起来。

(一)定值方式

核酸标准样品定值可采用以下两种方法：

1．在一个实验室采用权威方法，如PicoGreen DNA分子荧光定量法进行定值该测量方法的系统误差是可估计的，相对随机误差的水平可忽略不计。测量时，要求有两个或两个以上分析者独立地进行操作，并尽可能使用不同的实验装置，有条件的要进行量值比对。

2．由资格被认可的若干实验室使用同一种方法进行定值

参加合作的实验室应具有标准物质定值的必备条件，并有一定的技术权威性。合作实验室的数目或独立定值组数应符合统计学的要求。定
值负责单位必须对参加实验室进行质量控制和制定明确的指导原则。

实验室间试验定值的前提是存在有多个同等能力的实验室，采用统一的方法，且所得各单独结果之间的差异具有统计性质，因而能按纯统计程序进行处理。这种情况定值在各个实验室之间存在明显差异时，应注意从分析方法中找出问题．而不应盲目按统计学方法计算。

(二)定值质量保证

1．参加定值实验室的资质认证

IR0／REMCO导则34已明确对标准样品生产者的能力的通用要求，国家合格评定认可委员会已开始用该导则对标准样品生产者进行认可。我国计量部门也有计量认证的相关要求。

对于多个实验室联合定值情况，定值的组织单位应有明确的目标、详尽的计划、有效的组织姒及简洁有力的指导方针．包括目标时间、每个单元的重复测量次数、测量方法的详细说明、所用样品量等。

2．测量仪器的校准

要对测量仪器正确地进行校准、验证和维护，应定期对测量设备的性能(如响应、稳定性、线性、分辨率和重复性等)进行核查。对产生量值的计量仪器．如称量法测定中的天平、容量法测定ee的容量瓶、移液枪等都应经计量部门检定并应在检定周期内使用。

仪器的稳定性也十分重要．应该确保仪器信号至少在测量校准标准和被测样品所要求的这段时间内不随时间而漂移。

3．测量过程的质量控制

标准样品研制者应有明确的质量方针、质量管理措施以及出现问题后的纠正措施。对核酸标准样品的分析是在诸如溶解、取样、PCR扩增等众多过程之后通过PCR扩增仪的物理响应进行测定一它们中的任何一个过程或其全部过程都是溯源链中的环节，测量者必须评价每个过程在完全保留被分析物方面的救率。评估可能产生的不确定度并加以控制。加标样品、加标空白等可用于部分测量链的有效性确认．或用于辅助样品的定值过程。

建立和证明测量结果溯源性过程中需加以控制的其他方面包括：样品称量；试剂、溶剂纯度；常规实验室设备和玻璃器皿的校准情况；测量信号的干扰；用于计算并经确认的统计模型(如校准曲线)；测量过程的污染、损失和缺陷。所有这些都需要确认并控制。

(三)定值的统计学处理和不确定度评估

1．可疑数据取合准则

在一组测定值中，若发现某一测定值明显地比其余的测定值大得多或小得多．对于这样的测定值必须首先设法寻找其出现的原因，不能轻易的舍去，如果不能从实验的过程中判别其出现的原因，则可按统计方法来判别。对于核酸标准样品．可以使用狄克逊(Dix-on)准则，它使用极差法剔除可疑值，无需计算平均值和标准偏差(s)，使用简便。国际标准ISO4259：1 979、ISO 51 68：1 978、ISO5725：1 981等均推荐使用狄克逊准则。在核酸标准样品定值中，经常采用很多实验室进行分析测试．冈此得到很多组实验数器假定这些数据是等精度测量，可先用科克伦(Cochran)准则判断这多组数据中有无群一组是可疑数据．可使用最大方差组数据法剔除可疑组。

2．定值不确定度估计

标准样品特性量的测量总平均值即为该特性量的标准值。标准值的总不确定度由三个部分组成：第一部分是通过测量数据的标准偏差、测量次数及所要求的置信水平按统计方法计算出；第二部分是通过对测量影响参数和影响函数的分析．估计出其大小：第三部分是样品不均匀性和样品在有效期内的变动性所引起的不确定度。

3．定值结果的表示

定值结果一般表示为：标准值±总不确定度。

要明确指出总不确定度的含义并指明所选择的置信水平．总不确定度可以用标准不确定变表示也可用伸展不确定度表达。总不确定度一般保留一位有效数字．最多只保留两位有效数字。标准值的最后一位与总不确定度相应的位数对齐来决定标准值的有效数字位数。

 
六、计量溯源性
 

(一)测量溯源

称量法、容量法、热量法和分光光度法的溯源性已被证明和文件化。

(二)定值溯源

PicoGreen DNA分子荧光定量法对每瓶标准样品定值的溯源性是通过x噬菌体DNA标准品作为外标物，定值结果可以溯源到sI单位。

(三)PCR方法特异性引物和探针溯源

方法溯源性是通过PCR方法对核酸标准样品中的特异性基因片段进行扩增，所用的特异性引物和探针均能溯源到标准方法。

(四)基因鉴定

采用基因测序法对扩增的特异性基因片段进行测序确认。

来源：北京标准物质网www.biaowu.com