霍乱弧菌的样品制备

一、样品制备

将已保存的含有霍乱弧菌hιyA基因、rfb-01基因、rfb-0139基因和ctxAB基因标准质粒的单克隆菌和干扰菌分别进行增菌培养，经8000 r／min离心后，采用加热方式进行灭活．用含无菌保护剂溶液重新悬浮菌体．并按一定比例将含特定基因的单克隆菌和干扰菌混合均匀。

选择两种包装形式：

a)取0．5mL分装到Eppendorf管中冻于制样。

b)取1 mL分装到西林瓶巾冻干制样。

采用冷冻干燥工艺制备含有霍乱弧菌hιyA基因、rfb-01基因、rfb-0139基因和ctxAB基因的标准样品。选用德国CHRIST生产的2- 6D冻干机．设定冻干工艺，其中包括冷冻速度、真空度的设置、一次干燥和二次干燥时间和温度的设定等。

冻干后的标准质粒样品见图3-12a)、b)．将所得到的样品进行均匀性检验和稳定性检验并对其进行评价。

二、均匀性检验

(一)均匀性设计

采用普通PCR和定量C对样品进行均匀性分析。进行定量PCR检测时，在重复条件下检测多份阳性样品及阴性样品。结果数据用单因子方差分析(one way ANOVA)进行统计处理。

若F<自由度为(u₁、u₂)及给定显著性水平a(通常a=0．05)的临界值F_a(u₁、u₂)，则表明样品内和样品间无显著性差异，因而样品是均匀的。

(二)ctxAB基因

分别随机选取6个样品，采用荧光定量PCR检测，结果均为阳性，Ct平均值为20．64。均匀性试验结果(定量PCR的Ct值)，见表3-2。

ctxAB样品的均匀性检验方差分析结果见表3-3。

按a=0.05，u₁=5，u₂=6查表．F值=3．94<4．39，表明样品是均匀的

(三)hlyA样品

分别随机选取6个样品．采用荧光定量PCR检测．结果均为阳性．Ct平均值为：均匀性试验结果(定量PCR的Ct值)．见表3-4。

hlyA样品的均匀性检验方差分析结果见表3—5。

按a=O．05．u₁=11，u₂=12查表，F=3．05<4．39，表明样品是均匀的，见图3-14。

(四)rfd一O1基因

分别随机选取6个样品，采用荧光定量PCR检测，结果均为阳性，Ct平均值为20．13。均匀性试验结果(定量PCR的Ct值)，见表3—6。

rfd-O1基因样品的均匀性检验方差分析结果见表3-7。

按a=0．05，u ₁=5，u₂=6查表，F值=O．71<4．39，表明样品是均匀的，见图3一15。

(五)rfd-O139基因样品

分别随机选取6个样品，采用荧光定量PcR检测，结果均为阳性，Ct平均值为：均匀性试验结果(定量PCR的cr值)，见表3-8、表3-9。

按a=0．05，u₁=5，u₂=6查表．F值=2．42<4．39．表明样品是均匀的，见图3-1 6。

 

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