RNA功能基因片段标准样品的研制方案简介

  一、病毒RNA功能基因片段质粒的获取

(一)通过RT—PCR扩增、连接、转化得到RNA功能基因质粒

1．引物的设计：从NCBI核酸数据库中下载目的基因全序列．通过分子生物学软件比对这些序列并进行引物的设计．或者直接网络设计目的基因引物。

2．RNA的获取：直接通过各种经典或试剂盒方法从含有该目的基因的整个病毒中提取总RNA，获得所需功能基因RNA片段。

3．目的基因的扩增：首先以获取的RNA为模板．经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，然后再以cDNA为模板．通过聚合酶的作用扩增功能基因片段。

4．病毒功能基因扩增产物与体外转录载体连接

(1)体外转录载体的选择：通常用的体外转录的酶是T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶．因此选择的载体必须是含有T7启动子或是T6启动子的载体．例如，pGEM-T载体。

(2)功能基因扩增产物与体外转录载体连接：通过用相同的酶切功能基因扩增产物和体外转录载体，分别同收纯化．然后再将二者连接，转化到新的带有载体抗性的大肠杆菌中。也可以直接将PCR产物连接于含有T7启动子或SP6启动子的T载体中。

(二)可以直接合成功能基因。插入到含有T7启动子或SP6启动子的T载体中

(三)转化

1．感受态细胞的制备

(1)受体菌的培养

从LB平板上挑取新活化的E．coli DH5a单菌落．接种于3 mL～5mL LB液体培养基中．37℃下振荡培养过夜(1 2h左右)。将该菌种悬液以1；100的比例接种，取250μL菌液转接到25 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2h～3h至OD600=0．5左右。

(2)感受态细胞的制备(超净台中完成)

将菌液转入50 mL离心管中，冰上放置10 min。4℃下．4000 r /min离心10 min。弃去上清液．将管倒置1 min以便培养液流尽。用冰上预冷的0．1mol/L的CaCl₂溶液10 mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30 min。4℃4000 r/min离心10 min，弃去上清，加入2 mL预冷的0．1mol／L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞．冰上放置。

(3)感受态细胞的分装与冻存

在2 mL制备好的感受态细胞中加入2 mL30％甘油(即1：1体积．甘油终浓度15％).此感受态细胞分装成每份200μL(1．5 mL灭菌管)，液氮速冻，快速转入-70℃冰箱保存。

2．转化

将连接产物加入到制备好的感受态细胞巾．轻轻用移液器混匀．冰浴20 min，42℃热应激1 min．冰浴2 min。加入800μL SOC培养摹．150 g摇菌1．5h．1000 g离心10min，弃去培养液，加入新鲜的SOC培养基200μL．混匀后涂在含有Amp⁺的LB平板上，风干后，37℃倒置培养12h～1 6h。

3．阳性克隆的筛选鉴定

挑取单克隆菌进行培养，用PCR方法进行阳性克隆的筛选。

(四)测序

通过ABI 3730或其他型号仪器进行测序。

(五)病毒RNA功能基因片段质粒的增殖

将含有测序正确的重组子的菌液扩大培养，通过经典方法或试剂盒方法提取质粒。

二、体外转录

含有功能基因片段的载体上有T7启动子或SP6启动子，在T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶、合适缓冲液的作用下即可进行体外转录，也直接可以使用体外转录试剂盒。

三、稳定性基质的研究

目前标准样品根据制作的状态的不同，其选用的稳定性基质也不同，通常RNA类标准样品中均会添加一些抑制RNA酶类物质及延长RNA保存时间的物质。

四、均匀性

通常至少随机抽取15个样品，通过特定的测试方法和特定的统计学方法进行均匀性测定。

五、稳定性

根据稳定期限的长度选取样品．通过特定的测试方法和特定的统计学方法进行稳定性测试。

六、定值

通过8家以上有过该项目检测经历的实验室通过特定的方法和统计学方法对该标准样品进行定值。

来源：北京标准物质网www.biaowu.com