代谢途径清楚的代谢工程

  对于次级代谢产物的代谢工程来说，透彻理解生化途径、遗传特性和生物合成的调节机制是至关重要的。如果能得到这些信息，就有可能测定出前体和中间产物的流量，再依据代谢网络进行代谢流量分析和代谢控制分析，并识别限速步骤，从而为代谢工程提供推理依据(见图6．22)。

(1)动力学分析与遗传操作相结合抗生素生物合成途径是由许多酶介导的反应组成的。抗生素生物合成系统的动力学模型能帮助我们理解途径的动力学性质并鉴定限速步骤。进行敏感分析或代谢控制分析可以鉴定对生物合成速率影响最大的步骤。

Malfnber和Hu应用动力学分析方法分析了S．clauuligerus和Cephalosporium acre—rnonium两菌株的头孢菌素的生物合成，确定了形成δ—L—a一氨基己二酸一L一半胱氨酸一n缬氨酸(ACV)三肽的缩合反应为两菌株的限速步骤。在野生型S．clauuligerus中头孢菌素生物合成的体内动力学模拟和敏感分析也确定中间体己二酸(a—AAA)的生物合成为在三肽的三个前体中有最重要的速度控制强度。为提高a—AAA的流量，将基因lat通过同源整合转入s．clauuligerus染色体中。基因lat编码催化从赖氨酸转化到a—AAA的第一步反应的赖氨酸氨基转移酶(LAT)。结果重组菌的生产能力提高了2～5倍，a—AAA的胞内水平也有所提高。

(2)增加限速酶的启动子强度一旦参与生物合成途径的限速酶已确定，可以增加限速酶的基因剂量从而提高产物合成速率。也可以用强启动子取代原启动子来提高转录水平和酶活性。在产生青霉素Aspergillus nidulans的代谢工程中．用可诱导的乙醇脱氢酶启动子取代原启动子使ACV合成酶过量表达。A．nidulans在含10mmol／L环戊酮诱导剂中生长，与在不含诱导剂中生长相比，ACV合成酶水平提高100倍。该菌株在诱导条件下发酵，青霉素产量比野生型提高了30倍。

(3)改变代谢流到导向产物的分支 在分支途径中，一个分支流向终产物，而其他分支则会浪费原料。通过阻断不想要的分支或提高流向终产物的反应速率可使反应中间体流向终产物。头孢菌素C工业生产菌株C．acremonium的发酵液发现有青霉素N积累．细胞外青霉素N与头孢菌素C的平均摩尔比为0．3。由此推测青霉素N转化为脱乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)的反应较上游途径慢，结果细胞内青霉素N积累，导致高水平分泌到培养液中。为了降低细胞内青霉素N向细胞外分泌，克隆了DAOC合成酶基因cefEF，再将其导人头孢菌素C生产菌株．结果转化子的头孢菌素C产量提高了25％，而青霉素N的积累减少了15倍。分析表明转化子的cefEF基因剂量和脱乙酰氧基头孢菌素c合成酶表达量都增加了1倍。该工程菌已用于工业发酵，使工业发酵效价提高了15％。

另一个改变代谢流的成功例子是始旋链霉菌中消除了不想要的产物原始霉素PⅡ_B。PⅡ_B是合成原始霉素PⅡ_A途径的一个中间体．PⅡ_A合成酶使PⅡ_B转化为PⅡ_A。过量表达编码PⅡ_A合成酶的基因使菌株只产生PⅡ_A。

上述两个例子都是扩增一个酶使代谢流导向人们所希望的产物。这种改变代谢流的策略是成功的，部分原因是在代谢途径中缺乏强反馈调控。如果分支点是一个刚性节点，则仅仅增加下游反应的酶水平不可能导致代谢流朝有利方向重新分配。

(4)灭活导致副产物的基因  许多抗生素产生菌产生多种抗生素，它们中一些是生物合成途径中的中间体，一些是分支途径的副产物，另一些是完全不同的分子。在许多情况下，只有一种或少数几种是人们想要的，不想要的副产物的存在增加了下游分离过程的难度并限制总产量。通过消除副产物增加生产的选择性是人们所希望的。这可以通过阻断导致副产物的整个途径或使分支途径的第一个酶失活而达到。

这方面比较典型的实例是抗寄生虫的阿维菌素产生菌(Streptomyces auermitilis)的选育。s．auermitilis产生8种结构非常相似的阿维菌素A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b。这些组分中只有Bla、B1b具有抗寄生虫活性。另外，B2a可用作生产半合成阿维菌素——依维菌素B1a的前体。在这些产品中依维菌素B1a是最有效的抗寄生虫化合物。下游过程的挑战是分离有用组分并除去由产生菌产生的另一抗生素寡霉素。由于生物合成的主要组分已被阐明，编码酶的基因族也被定位，因此可利用通过代谢工程获得的菌株来设计一个过程。Ikeda和Omura利用随机诱变分离了一个只产A1a、A2a、B1a、B2a的菌株K2021和另一个只产B1a、Blb、B2a、B2b的菌株K2034。菌株K2034在编码5一。一甲基转移酶的基因aueD上有一个突变，而菌株K2021阻断了来源于缬氨酸的支链脂肪酸的掺人。通过原生质体的融合得到了同时具有上述两个突变的重组体，它只产生Bla、B2b。然后阻断负责转化B2a到Bla的脱氢步骤的基因aueC，得到的克隆菌株K2099只产生单一的阿维菌素B2a。但是该克隆菌株仍然产生寡霉素。为了阻断寡霉素生产，在野生型s．auerrmitilis中利用转座子Tn4560产生阻断克隆菌株。从这些阻断株中亚克隆染色体DNA片段到温度敏感质粒，并用于在K2099中阻断寡霉素的生物合成，从而得到一个只产生单一组分阿维菌素的菌株。

(5)半合成产物的生物合成对次级代谢产物进行生物转化或化学修饰常常能得到性能更好的抗生素。由微生物产生的化合物通常要进行进一步的化学处理过程。代替多步化学处理，通过引入来源于另一微生物的酶到产生菌中能得到单一步骤的合成。实际上这包括组合两个互补途径使次级代谢的代谢流导向一个新产物。通常将新的酶引入到高产的工业生产菌株中以利用工业生产菌株的已有的高产优势。

7一氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7一ADCA)或7一氨基头孢烷酸(7一ACA)是半合成头孢菌素的两个主要起始物质。这两个起始物质是从头孢菌素通过化学法或酶法除去na氨基己二酸侧链而制备的。Isogai等将两个分别编码n氨基氧化酶和头孢菌素酰化酶的异源细菌基因转入产生菌C.acremonium中生产7一ACA。为确保这些基因在真菌中表达，通过加入来自克隆菌株C.acremonium碱性蛋白酶基因的表达信号来修饰这些基因。所构建的菌株能够合成和分泌7一ACA，说明利用代谢工程引入抗生素生物合成途径片段是有潜力的。近年来已发展了另一个7一ADCA和7一ACA的生物合成途径。来自s．clauuligerus和C.acremonium的基因被引入青霉素生产菌株P．chrysogenum中，转化子在含己二酸的培养基中生长时产生含己二酸侧链的头孢菌素。再通过酰胺酶介导的转化将已二酸侧链除去，产生所需要的头孢菌素中间体。

(6)在异源菌株中合成抗生素  在许多链霉菌和真菌中，一个生物合成途径的整个基因族或部分基因的异源表达已被用于生产新的抗生素。在异源菌株中生产抗生素有许多优点，包括在受体菌中较高的前体流量．对终产物较好的抗性以及较少的副产物。在异源宿主中进行代谢工程也是非常有吸引力的，因为宿主有更先进的可使用的遗传学工具或比较了解的生理特性。

用两个分别编码异青霉素N异构酶和DAOC合成酶的杂合基因转化工业生产菌株P．chrysogenurn，能产生DAOC。在途径中引入了从中间体异青霉素N开始的新分支，导致产生DAOC。然而，该菌株保留了产生青霉素V的能力，因为流向青霉素V的途径没有被阻断。阻断这一途径非常困难，因为生产菌株编码负责转化异青霉素N为青霉素V的酰基转移酶的基因有多个拷贝。

总之，代谢工程正在被越来越多地用来开发微生物次级代谢的巨大潜力。分子遗传学工具的发展大大加深了人们对次级代谢产物合成的遗传结构和生理调控的认识，这反过来又大大提高了人们改造次级代谢的能力。然而，迄今次级代谢产物的代谢工程仍然局限于工程“局部”途径，即与生物合成直接有关的途径的设计。由于基本认识的不足，次级代谢与其他途径和细胞功能在生理学方面的相互作用，例如能量生产和消耗反应以及核糖体调控等，都在很大程度上被忽视。今后，随着基因组信息的大量积累，将大大促进代谢工程的发展。尽管工业微生物学家已成功地开发了大量的次级代谢产物，并且极大地提高了其产量，但是微生物合成次级代谢产物的潜力仍没有被充分开发出来．次级代谢的代谢工程任重道远。

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