病毒学研究方面的应用

  随着组织培养技术的发展，在许多领域均得到应用，如在病毒学、免疫学、药学、遗传学、分子生物学及基因1二程等方面。无论是对各领域的基础理论研究，还是对许多生产领域的发展均起到重大的推进作用。

自组织培养方法建立以后，就为病毒学的研究提供了可靠的研究手段。这与病毒增殖的性质有关。病毒必须在活的细胞内才能增殖，为此利用组织培养得以了解到病毒的生物学性状、致病机制等规律，促进了病毒学的飞快发展。主要应用有以下几方面：

(一)检测病毒

对病毒感染性疾病的微生物学诊断即从标本中分离鉴定病毒，对新分离病毒鉴定及制备疫苗等均需要增殖病毒或检测病毒。

1．增殖病毒利用组织培养细胞来增殖病毒。最早是由Maitland于1928年创立的组织片培养法来增殖病毒。不同种类的病毒一般均有敏感的细胞株，在敏感细胞株上病毒增殖快且增殖的指标明显。最主要的增殖指标是通过观察细胞病变来判定。观察细胞病变，是由Enders等确立的。如果有病毒增殖，在光学显微镜下就能观察到细胞变圆、坏死并从瓶壁脱落等现象，故称为细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。CPE往往随病毒种类和所用细胞种类不同而异，这些变化在一定条件下比较稳定，因此可根据有特征的CPE对某些病毒进行初步的识别。有些病毒可在培养细胞内形成包涵体、融合细胞以及代谢后培养液pH变化，这些变化均可作为鉴定病毒增殖和病毒种类的指标。

2．病毒定量研究利用组织培养技术增殖病毒，测定病毒含量，也是对病毒感染性的测定。对病毒感染性的研究，也是以组织培养法为基础。常用的方法有两种，一是蚀斑形成试验，二是50％组织细胞感染量的测定。

(1)蚀斑测定：该方法是Dulbecco和’Vogt于1954年创建的。其原理是将一定稀释的病毒悬液加入到单层细胞培养瓶中，吸附一定时间后再覆盖一层半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养层中不易扩散。结果每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶，用中性红染色，活细胞着色，形成灶的死细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒复制而形成的，故称为蚀斑形成单位(plaque forming unit，PFU)，该试验是一种检查和准确滴定病毒量的方法，用PFU／ml来表示。

(2)50％组织细胞感染量(TCID₅₀)测定法：该方法是测定病毒感染组织培养细胞后，引起50N发生感染的最小量。一般是将病毒10倍系列稀释后，分别接种细胞，经一定时间后观察细胞病变、血球吸附等指标，以最高稀释度能感染50％细胞的量为终点，计算出50％组织细胞感染量(50％tissue culturte infectious dose，TCID₅₀)。该方法是用半数感染量估计病毒感染性的强弱及含量，但不能准确测定感染性病毒颗粒的数量。

3.病毒和细胞间关系的研究病毒感染细胞在细胞内复制，能使细胞发生各种病理变化，这是研究病毒在细胞水平上致病机制的良好手段。例如病毒在细胞中增殖时，能在显微镜下观察到细胞病变死亡脱落等明显细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，这样的病毒，其致病机制主要是通过直接杀伤效应来实现的，致使被感染细胞死亡，如无包膜病毒便是如此。如果病毒感染细胞在显微镜下观察到细胞融合，出现多核巨细胞时，说明这些病毒不具有杀细胞效应，而是有包膜病毒引起细胞膜发生变化，导致感染细胞与邻近细胞的融合，借此方式病毒进行扩散。也可通过研究病毒与细胞受体相互作用、细胞凋亡机制、抗原变化及基因整合等情况从分子水平上来研究病毒的致病机制。

(二)病毒性感染的血清学诊断

对病毒性感染血清学诊断最常用的方法是中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等。其中中和试验多采用细胞培养方法进行测定。其原理是将系列稀释的病毒液与血清混合后，再分别感染细胞，测定病毒的感染性，观察血清对细胞的保护作用。如果细胞不出现病变，则证明血清中有病毒特异性抗体存在。中和效价是以能完全保护细胞不产生CPE的血清最高稀释倍数来表示。用此试验可检测患者血清中抗体的消长情况，常用于病毒感染的流行病学调查，也可用来鉴定未知病毒或研究病毒的抗原结构。

(三)肿瘤病毒致癌机制的研究

肿瘤病毒有使细胞发生转化、癌变的作用，利用细胞培养技术可以探讨肿瘤病毒对细胞的转化以至于致癌的机制。其原理将肿瘤病毒感染培养细胞，观察细胞的形态、增殖能力、永生性及遗传性等生物学性状的变化。

(四)制备病毒性疫苗

病毒疫苗有多种，包括减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、多肽疫苗及基因工程疫苗等。这些疫苗的制备和生产过程均必须采用组织培养技术来大量增殖病毒，特别是减毒活疫苗的研制必须经过反复传代诱变培养，筛选出对人毒力弱或无毒的病毒变异株，才能制备出减毒活疫苗。制备基因工程疫苗时，将病毒基因重组体导人原核细胞或哺乳动物细胞中进行表达的过程，亦需要细胞培养技术。

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