原代胰岛细胞培养法

  (一)材料

1．动物大鼠1～2只，250g左右。

2．胶原酶消化液(v型) 用D-Hanks配制胶原酶消化液(2．5mg／ml)，并加青霉素(100IU／ml)和链霉素(100μg／ml)。

3．培养液10％FCS RPMI1640，含青霉素(100IU／ml)及链霉素(100μg／ml)。

4．Hanks漓用于洗涤。

5．器具无菌平皿、培养瓶(玻璃或聚苯乙烯塑料瓶)，手术刀、离心管、手术剪及镊子等手术器具。

(二)培养方法

1．取材取材过程同上。无菌手术取下大鼠胰腺。

2．用Hanks(含青霉素l00IU／ml及链霉素100μg／ml)洗涤组织数次。用剪刀去除脂肪、淋巴结和结缔组织等非胰腺组织。

3．用剪刀将胰腺组织剪成2～3mm³大小的碎片。

4．将组织碎片放人一无菌瓶中，加入适量的消化液，置恒温水浴振荡器(转速为60～80r／min)于37℃消化10～15min。弃去上层消化液，用冷的D-Hanks终止消化，并洗涤2次。以1500r／min离心6min。用10％FCS RPMIl640培养液悬浮细胞沉淀，制成细胞悬液。取一定量的细胞悬液，用O．4％台盼蓝染色，观察细胞活性并进行细胞计数。活细胞比例应大于90％。以培养液将细胞配制成l～5×10⁵个／ml浓度，接种到培养瓶中，置37℃、5％CO₂培养箱中培养。培养2～3d后，用无菌注射器吸取一定量的培养液冲洗培养瓶壁，并用大口滴管收集培养液(内含被冲洗下来的非贴壁细胞)，接种到另一新培养瓶中。于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养。每两天换液一次。

(三)培养结果观察

在原代培养的最初2～3d内，培养瓶生长面可见有大面积融合的成纤维细胞铺盖。以后，在成纤维细胞层上逐渐出现了球形的细胞聚集物，直径为200～400μm。用培养液将这些疏松的球形细胞聚集物冲洗下来，并接种到另外的培养瓶中，培养48h后，可见多数贴壁细胞呈圆形或多边形，有时还可见到导管样结构。一般于21d左右即可长满胰岛细胞层。

三、胰岛细胞的鉴定

鉴定胰岛细胞常用两种方法。

1．同位素(RIA)法测定胰岛素 RIA法测定培养上清液中胰岛素水平．随培养时间延长，胰岛素水平有增高趋势。

2．荧光抗体检测法接种细胞前，在培养瓶中放一灭菌盖玻片，培养至盖玻片上长满细胞后(7～10d)，取出盖玻片，用D—Hanks洗涤3～5次，滴加荧光素标记羊抗鼠(或兔抗鼠)胰岛素抗体，温育2h，洗涤后用荧光显微镜观察荧光反应阳性的细胞，即为产生胰岛素的胰岛细胞。

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