神经胶质细胞的培养

  神经胶质细胞是广泛分布于中枢神经系统内的，除了神经元以外的所有细胞。具有支持、滋养神经元的作用，也有吸收和调节某些活性物质的功能。可分为少突胶质细胞(oligodendrocyyte)、星形胶质细胞(astrocyte)、施万细胞和小胶质细胞四种。神经胶质细胞有分裂的能力，故可进行传代培养。

(一)少突胶质细胞的培养

少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，它起源于胚胎神经管的神经上皮细胞，随着中枢神经系统的发育，逐步迁移到白质，并增殖、分化，形成髓鞘包裹轴突。

1．材料

(1)材料来源：新生1周内SD大鼠的脑组织。

(2)手术器械：解剖剪、解剖镊、眼科剪和眼科镊。

(3)培养皿和盖玻片：用O．01％PLL包被盖玻片，置温箱中烘干，使用前放入培养皿中。

(4)分离液：将9ml Percoll原液和lml10×HBSS混合后，用lOml HBSS稀释。

(5)消化液：1％胰蛋白酶。

(6)培养液：DMEM／F12混合培养液，添加15％FBS、6g／L葡萄糖、10万I U／L青霉素和100mg／L链霉素。

2．方法

(1)取材：通过颈动脉放血处死大鼠，无菌条件下取大脑，置人PBS液中，在解剖显微镜下剔除脑膜及血管，分离出大脑皮层。

(2)消化：将大脑皮层剪碎，加入1％胰蛋白酶，37℃水浴中振荡消化30min。加入2ml FBS终止消化，离心(1000r／min，10min)。

(3)细胞悬液制备：吸去上清液，用HBSS洗涤细胞2次，再用：100目滤器过滤。在滤液中加入HBSS，至20ml，制成细胞悬液。

(4)收集细胞：在50ml离心管中加入分离液，将10ml细胞悬液铺在分离液的上面。在4℃条件下，离心(14000r／min，45min)。离心管中的液柱自上而下呈现三层，即髓鞘层、少突胶质细胞和星形胶质细胞层、红细胞层。收集靠近髓鞘层的少突胶质细胞。用2倍体积的HBSS稀释，离心(2000r／min，10min)。

(5)培养细胞：吸去上清液．用HBSS混悬细胞，离心(1000r／min，10min)。用培养液混悬沉淀细胞，使细胞充分分离，然后以1×10⁶的密度接种于预先涂有多聚赖氨酸的培养瓶中，置于37℃、5％CO₂培养箱中，3d换液一次。

3．结果观察培养的细胞中95％以上为少突胶质细胞。培养24h后，大部分少突胶质细胞已贴壁生长。少突胶质细胞的胞体较小，呈圆形或三角形。胞质少，核较大而圆，核仁不明显。大多数细胞具有典型的双极或三极突起，细胞突起短，分支较少。若在培养液中使用有丝分裂抑制剂，少突胶质细胞在体外培养可达2个月。可用半乳糖脑苷脂免疫细胞化学染色及髓鞘碱性蛋白免疫细胞化学染色等方法鉴定少突胶质细胞。

4．注意事项少突胶质细胞膜上半乳糖脑苷脂的出现与少突胶质细胞发育的状态有关，如果培养物取材于出生前的胚胎神经细胞，则只有在体外培养7～lOd后才能表达半乳糖脑苷脂。

(二)星形胶质的培养

星形胶质细胞在中枢神经系统中发挥着多种作用，组成血脑脊液屏障，营养和支持神经元，与神经元突触的发生有着密切联系。

1．材料

(1)材料来源：新生1周内大鼠的脑组织。

(2)手术器械：解剖剪、解剖镊、眼科剪和眼科镊。

(3)培养瓶或培养皿：用O．01％PLL涂布底壁，备用。

(4)清洗液：HBSS。

(5)消化液：O．05％胰蛋白酶。

(6)培养液：DMEM和F12(1：1，V／V)混合培养液，添加15％FBS、6g／L葡萄糖、10万I U／L青霉素和100mg／L，链霉素。

2．方法

(1)取材：在无菌条件下，通过颈动脉放血处死动物，分离出大鼠大脑皮质。用预冷的HBSS冲洗3次后，在解剖显微镜下彻底剔除脑膜和表面血管。将皮质剪成1mm³左右的小块。

(2)消化：剪碎后加入O．05％胰蛋白酶，将组织块放37℃水浴中振荡消化30min。然后，加入培养液，终止消化，用吸管轻轻吹打，离心(1000r／min，10min)。

(3)细胞悬液制备：吸去上清液，加入新鲜培养液．然后用吸管轻轻吹打至组织块消散。调整细胞浓度至O．5×10⁶个／ml，将细胞接种于培养瓶中．培养：30min。翻转培养瓶，吸出瓶中含未贴壁细胞的培养液，用100目滤器过滤，将滤液离心(1000r／min，10min)。

(4)培养细胞：吸去上清液，用培养液悬浮沉淀细胞，将细胞接种于培养瓶中，放培养箱中静置培养。3d后换培养液，以后每隔2～3d换液1次。培养9～lOd。当细胞分层生长时，将培养瓶放入恒温水浴振荡器内，在37℃条件下螺旋水平振荡15～18h。吸去悬液，剩余的贴壁细胞即为星形胶质细胞。然后，进行传代培养。

3．结果观察培养4h后，可见细胞长出细小突起。培养3～5d后，细胞数目增多，星形胶质细胞的比例逐渐增大。9～10d后，细胞长满瓶壁，细胞分层生长，星形胶质细胞贴于底壁，少突胶质细胞位于星形胶质细胞层上面。经振荡纯化后，少突胶质细胞脱落，得到贴壁的星形胶质细胞。可用抗胶质原纤维性蛋白免疫细胞化学方法染色鉴定星形胶质细胞。

4．注意事项应注意振荡时间，以保证星形胶质细胞与少突胶质细胞的分离。

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