胚眙干细胞的分离培养

  目前在人ES细胞体外培养过程中，常常采用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层，后者可以为ES细胞提供营养物质和生长因子来支持ES细胞保持旺盛增殖能力和不分化状态。

一、小鼠胚胎干细胞的分离与培养

(一)材料

1．动物及胚胎来源将雌、雄小鼠按2：l合笼，次日晨见阴道栓者为O．5d记号，配种后3．5d断颈处死小鼠，剪开腹腔取出子宫角，以冲胚液冲洗子宫角，收集胚胎。

2．培养液配制

(1)ES培养液：DMEM培养液(高糖)，含4．5g／L葡萄糖、2mmol／L谷氨酣胺O．1mm01／L β巯基乙醇、lmmol／L丙酮酸钠、O．1mmol／L非必需氨基酸、15％CS、1000U／ml LIF(用STO饲养层时不用LIF)。

(2)冲胚液用M2或DMEM培养液，含10％CS和25mmol／L HEPES(pH7．4)

3．饲养层细胞或PMEF、STO细胞(SLN或STO／N／L细胞株)。

4．试剂

(1)消化液：O．25％胰蛋白酶O．04％EDTA，用无钙镁PKS配制，pH7．5。

(2)细胞洗涤液：D Hanks液。

(3)ES冻存液：DMEM(高糖)+lO％二甲亚矾(DMSO)+20％FBS或90％FBS。

(二)方法

小鼠胚胎干细胞分离与培养过程大体如下(图6-1)。

1．从胚泡中分离ES

(1)取受孕3．5d的小鼠处死，剪开腹腔取出子宫角，用冲胚液从子宫一侧冲出胚胎。受孕后18～24h为1d的胚泡；受孕2d的胚泡为受精卵第一次分裂后的两细胞期，3d的胚胎分裂为八细胞期，也称桑葚胚，受孕3．5d的胚泡处于此期。

(2)将小鼠囊胚随机放入铺有饲养层细胞(STO或PMEF)的4孔培养板上，每孔1枚，每孔加5ml ES培养液，置37℃、5％CO₂饱和湿度的CO₂孵箱中培养。

(3)培养后24h、48h与72h分别记录胚胎贴壁附着饲养层的生长行为。一般24～48h后，胚胎从透明带中孵化出来，随着饲养层的移动而黏附到培养皿上。此时可清楚地辨别出内细胞团(inner cell mass，ICM)。48h后ICM迅速生长。但如果是一组胚胎在一起，可能生长情况会有所不同，所以最好是每天检查胚胎是否为单个。

(4)4～5d后，ICM长成一簇簇的细胞团且未有分化现象，形似鸟巢状的小鼠细胞团衍生物。用无菌玻璃针拨动，使其与滋养层细胞分离。用D—Hanks液洗细胞团2次，用0．25％胰蛋白酶一0．02％EDTA消化细胞团5min，直至细胞团开始松散，并离散成小细胞团块，离开培养皿的底部。

(5)加ES培养液终止反应，然后转移至离心管中，1000r／min离心5min，弃上清液，轻轻将细胞重新悬浮在Es培养液中。

(6)1：5的比例稀释细胞，移种到新制备的有饲养层细胞的培养板上，置37℃、5％CO₂、饱和湿度的孵箱中培养。如此每隔2～3d重新传代1次。凡不具有分化表型的小鼠ICM集落再传代培养。

2．原始生殖细胞(primordial germ cell，PGC)的分离与培养

(1)无菌条件下收集受孕8~10d的大鼠(人的生殖干细胞是受孕5～9周的)胚胎，用D—Hanks液洗2次。

(2)解剖镜下剥离生殖嵴(genital ridge)及其周围组织，并用眼科剪充分剪碎，用含青霉素、链霉素的无钙镁PBS洗2次，吸弃洗液。

(3)用0．05％胰蛋白酶一0．02％EDTA(PBS配制)或0．25％胰蛋白酶液于37℃水浴中消化5~10min，或用0．1％胶原酶V型和0．002％PNaseI型于37℃水浴中消化2h，吸出消化液。再加入1～2m1胰蛋白酶消化液．37℃消化5～10min。

(4)合并2次消化液，1000r／min离心5min，弃上清液。将消化好的细胞重新悬浮在ES培养液中，轻轻吹散细胞并接种在有饲养层细胞的培养皿中，饲养层细胞用50Gγ射线处理过。饲养层为PMEF时，在ES培养液中加1000U／ml LIF和10μg／L hrbFGFi如果饲养层用STO细胞(SLN或STO／N／L细胞株)，则不用另加。

(5)将接种好的细胞置37℃、5NCO₂、饱和湿度的孵箱中培养。7d后用0．05N胰蛋白酶一0．02％EDTA(37℃)消5~10min，进行传代。

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