活细胞直接观察方法

  (一)相差观察和摄影

1．相差装置的使用相差装置或显微镜都是由两部分组成，相差聚光器和相差接物镜。在每个相差接物镜的光学系统中都有一个光环透镜；在聚光器内有数个可转换的相位板，一定倍数的接物镜使用时需与相应的相位板一致。相差观察时对照明要求严格，光轴要对正，视野照明光度需均匀。

2．操作步骤

(1)调好相位板，使聚光器相位板号与接物镜放大倍数(相位板)相一致。

(2)抽取接目镜，再更换辅助望远镜，移动辅助镜筒并调整聚光器相位板，使视野中两个大小一样的光环必须相互吻合。

(3)再重新换上原接目镜，即成相差图像；当更换不同倍数接物镜时，需按上述过程重新调节。

3．注意事项

(1)对培养瓶、皿要求：相差显微镜观察要求底物平坦、质地均匀、透光度强；一般玻璃器皿凹凸不平，不适合做相差观察和摄影，用质地均匀的塑料器皿培养较好。

(2)准备：观察和摄影前，要擦净培养瓶表面，切勿残留污迹而影响透光度。

(3)调光：调整照明光的照明度及光轴，使视野照明均匀。对准光轴是显微摄影的重要条件，否则不易获得理想效果。

(4)在无自控摄像装置初次拍摄时，应将放大倍数、照明强度和曝光等条件逐一记录，再做一组不同曝光时间的试验．显影后选取最佳组合，作为以后再拍摄时的标准。

(二)细胞

培养细胞生长在瓶底上，最适用倒置光相差显微镜观察，而且需附有长焦距集光器，才能观察厚度较大的培养平皿。培养瓶壁厚度一般均大于20μm，只限于用40×接物镜，若用油浸镜观察细胞更细微结构，需用支持物培养法，将细胞培养在长方形盖玻片上，观察时应从瓶中取出，制成临时标本。

1．取一大型载物片，另取小块滤纸剪成长方形，置于载玻片上。

2．用吸管向滤纸框中滴加数滴培养液，使之充满框内空间和浸湿滤纸框。

3．把生长有细胞的盖玻片放在纸框中(使细胞面向上)，再覆以大盖玻片。

(三)注意事项

1．观察时液体不断蒸发．随时应从标本侧方滴加营养液，但不宜过多，以防液体浸过上方大盖玻片．影响油浸观察和摄影。

2．本法只限短时间观察细胞之用。在使用加温载物台对维持细胞功能更好，但能观察2h左右。观察时间过长，随培养液蒸发、pH改变，细胞形态和机能状态都将发生改变。

三，缩时显微摄像术和闭路电视记录

缩时显微摄电影术(time—lapse clnemicrophotography，TLCM)是直接记录活细胞动态变化最为理想的方法，本法能记录细胞连续动态变化过程。因细胞动态变化过程缓慢，为能达到肉眼可见的程度，需用TLCM法或定格拍摄法。用TLCM法拍摄细胞时需用具有TLCM装置的显微镜，如Nikon和Olympus均有该产品，可用于拍摄记录细胞动态变化，如细胞运动、细胞分裂、细胞膜变化、细胞死亡等过程。TLCM法的不足之处在于拍摄后底片加工繁琐。用TLCM法进行拍摄或闭路电视记录培养细胞超过48h时，培养液中应加HEPES或安装自动换液系统，以维持培养液较恒定的pH、更新营养成分、去除代谢产物，使细胞能良好生长。

来源：中国微生物菌种网www.bnbio.com