扫描电子显微镜技术

  扫描电子显微镜(scannlng electron microscope)技术可用来观察培养细胞的外部三维形状及其表面的微细结构，因此，无需切片而是力求保持细胞完整性。要进行扫描电镜观察的细胞最好培养在易于移动的支持物(如盖玻片、聚苯乙烯薄膜)上。扫描电子显微镜用电子束与一个阴极射线管的电子束同步扫描标本，使之形成一个具有三维结构的图像，此图像可以显示细胞的表面结构，这是透射电镜所不及的。此外，扫描电镜标本的制作简便，周期短，不需要切片和染色。通常，为获得维持原材料形状不变的细胞结构，需对样品进行干噪，此外，为防止电子在标本上聚焦，还需用镀金方法使标本导电。

(一)原理

自电子枪阴极发射出来的电子受到5～30kV的电压加速，经两个聚光镜和物镜组成的电子光学系统形成极细的电子束，并聚焦于样品表面。入射电子与样品中的原子相互作用，产生二次电子信号，信号大小依照样品表面的形状而异。使二次电子加速至10K'v’左右，并射到由闪烁塑料光导管、光电倍增管等组成的探测器上，再经视频放大后调制显像管的亮度。当入射电子束在扫描线圈的作用下在标本表面逐点、逐行扫描时，由于显像管的偏转线圈电流与扫描线圈中的电流同步，所以显像管荧光屏上任一点的亮度便与标本表面上相应点发出的二次电子数相对应，结果在荧光屏上形成标本的表面图像。图像可直接在荧光屏上观察．亦可拍照记录。

(二)样品制备

1．取材与清洗生物组织标本，包括血细胞和培养的肿瘤细胞均应事先充分冲洗，去除附于组织或细胞表面的组织液、血浆与黏液，使其充分暴露出其表面的构型。通常，用Palade缓冲液清洗培养于盖玻片上的细胞、组织标本2次。若未能洗净细胞、组织的表面，则可根据具体情况，考虑选用合适的酶进行处理。

2．固定将冲洗后的组织或细胞在2．5％戊二醛中固定30min～2h，用Palade缓冲液洗涤2次(20min／次)。用4℃、1％OsO₄固定：30min～2h，用Palade缓冲液洗涤2次；10min／次)。

3．脱水为了防止组织和细胞在干燥时变形，常用脱水剂(丙酮或丙酮一醋酸异戊酯)进行浓度梯度脱水。

(1)丙酮脱水法：配制30％、50％、70％、90％、|00％的丙酮，样品从30％丙酮逐级够至l0O％丙酮，每次脱水15min～2h。

(2)丙酮一醋酸异戊酯脱水法：配制30％、50％、70％、90％、100％的丙酮一醋酸异戊酯脱水剂，样品从30％脱水剂开始，逐步移至100％的脱水剂。

(3)干燥：生物标本与细胞均含有一定的水分，一般干燥后会使细胞扭曲变形，改变细胞的真实形态与结构。常用的方法如下。

1)空气干燥法：将已固定、脱水的标本在空气中自然干燥。用此方法时，表面张力的牵持可使细胞收缩变形。另外，标本的水分急骤汽化时，可因温度的降低而形成水晶，影响细胞与组织的形态结构。

2)冷冻干燥法：将已固定与丙酮脱水的标本放至5cm×5cm的样品杯中，置液氮中冷冻。再将放有样品的杯防御真空喷镀仪中抽真空，使固化液氮和标本或细胞中的丙酮升华，得到干燥样品。此法简便易行，不要求特殊设备，也不会出现由于表面张力的牵拉而引起的样品损伤，但因急速冻结易产生冰晶，故可导致组织、细胞膨胀等损伤。

3)临界点干燥法：将浸入醋酸异戊酯的标本取出，放入特制的标本盒内，送人临界点干燥仪的封闭标本室内。将此室充以液态CO₂(临界温度为31．4℃，临界压力为72atm)，然后加温到15℃，使液态CO₂与标本中的醋酸异戊酯置换15min。然后打开泄气阀使CO₂缓缓放出，自盒中取出干燥后的标本。具体注意事项包括：①标本应预先充分固定与脱水，并确定观察面；②保证标本室及相关管道的清洁，以防止标本污染；③封闭标本室及CO₂瓶内的压力非常高，有关部位螺旋应拧紧，以防发生意外；④排气速度不宜过快，温度应控制于45～50℃，否则标本可能膨胀；⑤封闭标本室内的CO₂液体必须浸没标本，否则不能做到临界点干燥。

(4)喷镀：将干燥后的标本用导电胶粘在样品托上，待导电胶干燥后，立即将样品托上的标本置于真空喷镀仪内，先喷一层lOnm厚的碳膜，然后再喷镀一层10～20nm厚的金或铂膜。镀膜后的标本可在扫描电镜下观察，或保存于干燥器内。

(三)观察方法

先打开电源，抽真空，待达到设定的真空度后，放人样品，进行加速高压选择、观察区域选择、放大倍数选择、倾斜度选择、工作距离选择、图像聚焦、观察及拍照记录。观察完成后，取出样品，关闭显微镜。

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