细胞生长曲线法

细胞生长曲线(cell growth cilrve)是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法，是研究细胞在一代生存期内的增殖过程的重要指标。常用方法有细胞计数法。它以培养时间为横坐标，细胞密度为纵坐标。细胞生长曲线可用于分析细胞增殖速度，确定细胞传代、细胞冻存或具体实验的最佳时间。细胞增殖曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。

一、细胞计数法

(一)材料

1．待测细胞悬液。

2．24孔培养板。

3．消化液：O．25％胰蛋白酶和O．0256 EDTA混合消化液。

(二)方法

1．培养细胞取生长状态良好的细胞，制成细胞悬液，经计数并记录接种的细胞悬液之密度后，在培养板的21个孔内分别接种相同数量的细胞(如果使用培养瓶，则需接种21瓶)。接种时间记为0h。

2．计数细胞密度从接种时问起，每隔24h吸弃3孔中培养液，加入消化液，混悬细胞并计数3孔(瓶)内的细胞密度，求平均值。为提高准确率，对每孔(瓶)细胞可计数2～3次。如此操作至第7d结束。

3．绘制曲线以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，标出各点并连成线，即得所培养细胞的增殖曲线，如图8-l所示。

(三)结果分析

细胞增殖曲线反映细胞的生物学特征，标准的曲线呈近似“S”形。每一代细胞的生长过程可大致分为潜伏期、对数生长期和停滞期。一般在传代后第一天细胞数有所减少，经过几天的潜伏适应期后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。

1．潜伏期是细胞对分离和传代操作所致的损伤的恢复以及适应新生长环境的过程。原代培养细胞需要24～96h。，甚至更长时间才能恢复增殖。不同细胞的增殖恢复所需的时间不同，如肿瘤细胞比二倍体细胞恢复得快。传代细胞的潜伏期一般为6～24h。

2．对数生长期细胞数量呈对数增长，对数生长期一般为3～5d，常以倍增时间(即生长曲线上细胞数量增加一倍的时间)来表示细胞生长旺盛情况。细胞生长倍数则是指测定接种时活细胞的浓度，经一个生长周期达到最大活细胞浓度的比率。细胞传代、指标测试等多在此区间进行。

3．停滞期细胞不再增殖，生长活动停滞。

(四)注意事项

1．培养板各7L内细胞的消化操作过程要一致，以免造成细胞浓度的明显差别。

2．计数前，应尽量使细胞混悬均匀。每孔内加入的细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。

3．细胞接种数量应适宜。一般接种数量以7～10d能长满而不发生生长抑制为宜。数量过少将导致细胞适应期延长，数量过多易使细胞快速进入增殖稳定期。

4．细胞增殖曲线可有20％～30％的误差，需较精确反映生长数值时，需结合其他指标进行分析。

二、WST一8检测法

WST-8是一种新型的水溶性四唑盐，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成具有高度水溶性的橙黄色甲臌产物，其颜色的深浅和活细胞的数量呈正比。含WST一8成分的CCK 8(cell counting kit一8)试剂盒已广泛应用于检测细胞增殖和细胞毒性。其检测方法简单介绍如下：

(一)材料

1．待测细胞。

2．96孔培养板。

3．10％FBS培养溶液。

4．CCK 8试剂盒。

5．酶联免疫检测仪。

(二)方法

1.96孔板中每孔加入200 μl含10％FBS的细胞培养液进行培养，并进行实验分组。

2．每隔24h酶联免疫仪测定各组细胞在450nm波长处的吸光度值，连续监测7次。

(三)结果分析

计算各个实验分组的吸光度值的平均值，设时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制生长曲线。

(四)注意事项

为了获得更为可靠的实验数据，应至少重复3次实验，以提高实验结果的可靠性。

来源：中国微生物菌种网www.bnbio.com