细胞内蛋白质含量的测定

    细胞的表达产物主要包括一些结构蛋白和功能蛋白等，检测细胞的表达产物可以观察细胞的基因表达情况，评价细胞的生长状态等。

(一)原理

细胞中蛋白质含量可反映细胞生长、增殖的状况，从而反映药物对细胞的毒性作用。测定时，先将细胞溶解释放蛋白质，再加入游离状态的考马斯亮蓝G一250，在酸性条件下考马斯亮蓝G一250呈红褐色，与蛋白质结合后呈蓝色。在一定的浓度范围内蛋白质含量与颜色的深度成正比，通过比色并与标准蛋白质比较可得出蛋白质浓度，因而计算出细胞中蛋白质含量。

(二)材料

1．96孔培养板培养的待测细胞与对照组细胞。

2．O．5mol／L NaOH。

3．生理盐水。

4．蛋白质标准溶液(600μg／ml)  血清白蛋白(BSA)60mg，加生理盐水至100ml，使充分溶解。

5．考马斯亮蓝G一250溶液考马斯亮蓝G一250 100mg，加95％乙醇50ml，加85％磷酸100ml，加蒸馏水至1000ml，置于棕色瓶中过夜，用双层滤纸过滤。

6．可见分光光度计、试管、吸管等。

(三)方法

1．标准蛋白质曲线的绘制取小试管7支，按表9—1操作。

混匀后静置5min，分光光度计下，以1号为空白，595nm处比色。以各管光密度值为纵坐标，以各管蛋白质浓度为横坐标，绘成标准曲线。

2．蛋白质含量测定吸取培养板各孔培养液，加入与培养液等量的生理盐水洗涤，弃去生理盐水，然后加入等量的O．5mol／L NaOH，以使细胞释放蛋白质，然后按表9—2操作。

 
混匀后静置5min，分光光度计下，以对照管为空白，595nm处比色。根据标准曲线确定样品中蛋白质浓度。

(四)结果

每培养孔蛋白质含量(μg／孔)一测定的蛋白质浓度(μg／ml)×每孔加入的O．5 mol／L NaOH的体积(ml)×稀释倍数

药物细胞毒性越大，每培养孔中蛋白质含量越低。

(五)注意事项

1.测定的各管光密度值若太高，应对待测液进行稀释。

2．蛋白质测定方法较多，也可采用其他方法，如酚试剂法、双缩脲法、Lorry法等。

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