免疫沉淀法检测表达蛋白质

  免疫沉淀法可用于检测并定量分析多种蛋白质混合物中的靶抗原。这种方法很敏感，可检测出100pg的放射性标记蛋白。当与SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳并用时，即可用于分析外源基因在原核和真核宿主细胞中的表达情况。

放射性标记靶蛋白的免疫沉淀及其分析包括下列几个步骤：①靶蛋白的放射性标记。②裂解细胞。③特异性免疫复合物的形成。④免疫复合物的分离及纯化。⑤放射性标记蛋白质的免疫沉淀分析。

(一)靶蛋白的放射性标记

用于标记蛋白质的放射性同位素通常是³⁵s，其半衰期为87．1d。用同位素标记蛋氨酸、半胱氨酸，它们是哺乳动物细胞的必需氨基酸，必须由培养液提供。因此，培养的哺乳动物细胞的放射性标记就可以通过将细胞培养在含³⁵s蛋氨酸或同时含³⁵S蛋氨酸³⁵s半胱氨酸的培养液中来进行。

由于培养液中含有高浓度的蛋氨酸和半胱氨酸，为了增加同位素标记氨基酸的掺入率，可去除培养液中的蛋氨酸或同时去除蛋氨酸和半胱氨酸。同位素标记的强度取决于被检蛋白的合成速度及其氨基酸的组成，以及该蛋白质的代谢速度。

1．标记方法

(1)吸去培养液，待检细胞用不含蛋氨酸和血清的培养液(Med—AA)洗2次。

(2)于Med—AA中37℃培养20min，以耗尽细胞内的含硫氨基酸。

(3)吸去Med—AA，立刻换含适量³⁵s标记氨基酸的Med—AA，按所需时间于37℃中培养。

(4)吸去含有同位素的培养液。如果只检测细胞内的抗原，则弃去含同位素的培养液；如果被检抗原是分泌型蛋白质，则留下培养液进行免疫沉淀。

(5)用冰冻的1×PBS洗2次细胞，尽量吸去残留的1×PBS，然后即可进行细胞裂解。

2．注意事项在短期标记(<1h)中，为了增加同位素标记氨基酸的浓度，应使培养液的体积尽可能的小，下列是一个参考值(表9-5)。

每隔15min轻轻摇动一下培养皿，以免细胞干燥。当进行较长时间的标记(>6h)时，培养液中的所有同位素标记氨基酸都要耗尽，因此有必要补充相应的非同位素标记氨基酸，以保持细胞的正常生长。通常情况下1／10体积的完全培养液即可。

(二)裂解细胞

1．材料

(1)培养皿培养的细胞。

(2)裂解缓冲液

1)第一种：含50mmol／L Tris—HCl(pH8．0)、150mmol／L NaCl、O．02％NaN₃、0．1％SDS、100μg／ml PMSF、lμg／ml抑蛋白酶肽(aprotinin)、1％NP一40。

2)第二种：含50mmol／L Tris—HCl(pH8．0)、150mmol／L NaCl、O．02％NaN₃、100μg／ml PMSF、lμg／ml抑蛋白酶肽、1％TritonX一100或l％NP-40。

3)第三种：含50mmol／L HEPES、500mmol／L NaCl、1％NP一40、lμg／ml抑蛋白酶肽、100μg／ml PMSF。

4)第四种：含50mmol／L HEPES(pH7．0)、1％NP一40、lμg／ml抑蛋白酶肽、10μg／ml PMSF。

(3)PMSF贮备液：17．4mg PMSF，溶于lml异丙醇中，一20℃保存。

2．方法

(1)向培养皿中加入裂解缓冲液，冰浴20min。下列数值可作参考(表9—6)。

(2)用橡皮刮子刮下培养皿中的细胞，将裂解缓冲液及细胞碎片吸人一预冷的微量离心管中。

(3)于4℃下10000r／min离心2min。

(4)将上清液吸入一新的微量离心管中，4℃或70℃保存。

3．注意事项

(1)PMSF(一种丝氨酸蛋白酶的抑制剂)对呼吸道黏膜、眼睛及皮肤等极具毒性，如果被吸人或接触到皮肤，应立刻用水冲洗。由于PMSF在水溶液中不稳定，所以要在临用前再加至裂解缓冲液中。

(2)上述步骤均应在冰冷的条件下进行，以免蛋白酶抑制剂失活而导致蛋白质的降解。

(三)抗原抗体复合物的形成及收集

将被检蛋白的特异性抗体加至上述细胞裂解液中，所形成的抗原一抗体复合物可通过下列几种方法收集：①用SPA—Sepharose进行吸附：这种方法的结果清晰，因为SPA—Sepharose与无关蛋白质几乎不发生非特异性吸附。但是这种方法成本高，并且所需抗体有种系特异性的限制。②用经热致死并经甲醛固定的能分泌SPA的金黄色葡萄球菌(S．aureus)细胞进行吸附：这种方法背景增加，但较SPA—Sepharose法经济。③用被检蛋白抗体的抗体进行吸附：这种方法用于下列两种情况，即第一抗体的Fc不能被SPA识别和对被检蛋白进行定量分析时。

1．材料

(1)细胞裂解液。

(2)NET—gel buffer 含50mmol／L This HCl(pH7．5)、150mmol／L NaCl、0．1％NP-40、1 mmol／L EDTA(pH8．O)、0．25％白明胶、0．02％NaN₃。

(3)1×SDS gel一Loading buffer 含50mmol／L Tris HCl(pH6．8)、100mmol／LDTT、2％SDS、O．1％溴酚蓝、10％甘油。

2．方法

(1)将上述细胞的裂解液等分，放人2支微量离心管中，用NET gel buffer调节体积至O．5ml，向一个管中加被检蛋白的特异抗体，向另一个管中加入无关的单克隆抗体。在0℃下轻轻地摇动1h。

(2)如果被检蛋白抗体不能有效地与SPA结合，可加适量的抗免疫球蛋白抗体，并继续在0℃轻轻地
摇动1h。

(3)向抗原一抗体混合液中加入SPA—Sepharose，于4℃下轻轻地摇动1h。

(4)于4℃下10000r／min离心lmin，吸去上清液，加1ml洗涤buffer重悬Sepharose，共洗3次，前两次用NET—gel buffer洗，最后用10mmol／L tris- HCl(pH7．5)、0．1％NP-40洗1次。

(5)于4℃下振荡20min，10000r／min离心lmin，弃上清液。

(6)向沉淀中加30”11×sDs ge卜Loading buffeL

(7)100℃加热3min，10000r／mill离心1min，收集上清液至一新管中。

(8)标记蛋白质的放射自显影分析将上述收集的上清液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳．干胶，压片．放射自显影。详细操作过程见本书其他有关章节。

3．注意事项

(1)抗体的用量取决于抗原的浓度及抗体的滴度。一般来说，对转染的哺乳动物细胞提取液进行免疫沉淀时，需要O．5～5μl多克隆抗血清或5～l00μl杂交瘤组织培养液或O．1～1．0g腹水。如果抗体的用量过多，则增加非特异性的背景。

(2)用NET—gel burfer稀释细胞抽提液可降低非特异的背景，但表面活性剂浓度过高
则导致蛋白质的部分变性或降解。

(3)所需SPA—Sepharose的量应作预实验来确定。一般来说，1ml包装的已膨胀的SPA—Sepharose至少能结合20nlg IgG；1ml标准的10％悬浮S.aureus细胞能结合1mg免疫球蛋白。

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