细胞凋亡的形态学检测法

  (一)凋亡细胞的形态学特征

凋亡的细胞有相似的形态学特征，主要表现在：细胞膜完整，细胞连接和微绒毛消失，细胞骨架紊乱，黏着力降低，单个细胞与邻接细胞脱离；核纤层蛋白降解，细胞核的染色质凝集和边缘化，裂解为碎块，细胞核最终裂解为由核膜包裹的碎块，细胞器基本保持完整一细胞质密度核质浓缩，细胞皱缩，细胞膜收缩并内陷，将细胞自行分割为多个具有膜包围的、内含各种细胞成分的凋亡小体(apoptotic body)。凋亡细胞不发生细胞膜、溶酶体等膜结构的破裂，因此不引起细胞内容物外溢，故不引起炎症反应和周围组织损伤。细胞凋亡是单细胞的丢失，其结局是凋亡小体被机体单核一巨噬细胞、正常上皮细胞、血管内皮细胞识别、吞噬，迅速被降解。光学显微镜下主要通过检测细胞核的变化和观察凋亡小体的形成鉴别凋亡，一般选用的细胞为悬浮细胞。

(二)凋亡细胞的光镜观察

1．材料

(1)待检细胞(5×10⁶／ml。

(2)试剂

1)吉姆萨原液：0．8g吉姆萨粉，加入50ml甲醇中，研磨，加温至58℃，搅拌2h。待染料彻底溶解后，缓慢加入50ml甘油，充分摇匀，放置于37℃孵箱中保温8~12h，转入棕色瓶中密封保存。

2)吉姆萨工作液：使用前取lml吉姆萨原液，与9ml PBS混合即可使用。

(3)器具：显微镜、载玻片、孵箱、研钵、离心机、盖玻片、树脂。

2．方法

(1)培养的细胞悬液置于4℃环境中，500r／min离心6~8min，去除上清液。将细胞重新悬浮于PBS中，使细胞浓度达到1×10⁶／ml。

(2)吸取0．1ml细胞悬液，均匀涂布于清洁的载玻片上，干燥后用甲醇液固定1min，晾十。

(3)在载玻片上加数滴吉姆萨工作液，室温下染色5min，用清水洗去染液，室温晾干24h。

(4)将玻片标本在二甲苯中浸泡3min，透明，以树脂封片。

(5)普通光学显微镜下观察细胞核的形态。分析100个细胞，计算凋亡百分率。

3．结果 光镜下可以观察到凋亡细胞染色质浓缩、靠边，核膜裂解，染色质被分割成块状，以及凋亡小体等典型的凋亡形态。

(三)凋亡细胞的电子显微镜观察

1．材料

(1)待检细胞(5×lO⁶／ml)。

(2)1％锇酸、2．5％戊二醛、丙酮、包埋剂、PBS。

(3)切片机、透射电镜。

2．方法

(1)培养的细胞置于4℃环境中，500r／min离心6~8min，收集5×10⁶个细胞，将细胞用PBS洗2次。

(2)将细胞悬浮于2．5％戊二醛中，固定不少于30min，用PBS洗2次。

(3)将细胞悬浮于1％锇酸中，固定lh。

(4)用丙酮梯度脱水。

(5)将细胞置于丙酮一包埋剂(1：1)中置换30min。然后在包埋剂中浸2h，按常规包埋、切片。

(6)透射电子显微镜上观察细胞形态、细胞质及细胞核的变化，记录实验结果并照相。

3．结果凋亡细胞体积变小，细胞质固缩，细胞核体积变小，染色质浓缩并凝结成块状，形成染色质沿核膜内侧排列的所谓“核边集现象”。细胞凋亡晚期，细胞核裂解成碎块，产生凋亡小体。

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