病毒定量法(蚀斑形成试验

  蚀斑形成试验(plaque forming assay)是目前测定病毒感染性最精确的方法，可以测得活病毒颗粒数。原理是将适当浓度的病毒悬液加入已成层的单层细胞培养中，使病毒吸附．再覆盖一层融化的琼脂。每一个病毒在感染细胞内复制后，可产生一个局限的感染灶，此即蚀斑。用中性红染活细胞，可见未染上颜色的空斑。每个蚀斑是由一个感染性病毒体复制产生的，称为蚀斑形成单位(Plaque forrning unit，PFU)，即一个空斑就相当于一个病毒体。病毒悬液中含有的感染性病毒量，以每毫升能形成的蚀斑形成单位来表示，即PFU／ml。

(一)材料

1．待测病毒液单纯疱疹病毒1型(HSV-1型)约10^-6 TCID⁵⁰／ml。

2．细胞Vero细胞单层培养平皿(60mm)或单层细胞培养瓶18只。

3．含2％FCS的MEM(或RPMI 1640)维持液、Hank’s液。

4．1．5％琼脂覆盖培养基。

A液(50ml)：lO×MEM(不含酚红)9．5ml、FCS 5．0ml、7．5％NaHCO₃2．9ml及灭菌蒸馏水32．6ml，无菌配制，置37℃水浴箱预温。

B液(50ml)：琼脂1．5g溶于50．Oml蒸馏水中。121℃高压灭菌15min。后，置56℃水浴箱中预温。

同时A液、B液等量混合，现用现配，保温42℃左右待用。

5．1％中性红琼脂培养基(c液) 10×MEM 5ml、琼脂O．75g、1％中性红及44ml去离子水，121℃高压灭菌15min，50℃水浴预温，用前加7．5％NaHCO₃1．5ml。

(二)方法

1．病毒的稀释与接种取9支小试管，将待检病毒用维持液10倍系列稀释，从10^-5之后加半log稀释到10^-7，具体方法见表10-4。

将培养24h单层细胞各平皿(或培养瓶)内生长液弃掉，将病毒液接种于细胞上。按不同倍数稀释的病毒液10^-7、10^-6.5、10^-6、10^-5.5、10^-5和维持液对照等6组接种，每组设3只平皿(或培养瓶)．每皿(瓶)接种O，5ml，充分铺满并吸附1h。每15min摇动1次使之均匀地接触细胞。

2．覆盖琼脂培养基将42℃预温的覆盖培养基(A、B液等量混合)迅速吸取4～5ml加入各细胞培养皿(或瓶)中铺盖于已接种病毒的单层细胞表面，待琼脂凝固后，将琼脂层向上，置37℃培养3～4天并逐日观察。

3．染色并计数蚀斑培养第4日向各培养皿(瓶)中加50℃预温的C液培养基(1％中性红琼脂培养基)2ml，待凝固后，置37℃培养数小时(或过夜)后计数蚀斑。由于中性红可使活细胞着色，病毒感染灶则形成无色空斑。

计数时选择空斑不融合、分散呈单个、数目在30～100个／瓶的培养瓶，分别计算各病毒稀释度的空斑数，并求3瓶平均值，按下列公式计算。

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