混合淋巴细胞培养

  (一)原理

混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture，MLC)或称混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR)，包括双向和单向混合淋巴细胞反应两种。两个无关个体功能止常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAⅡ类抗原中D和DP抗原(淋巴细胞鉴定的抗原，SD抗原)不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此为双向混合淋巴细胞培养(双向MLC)；若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C(myrtomycine C)处理或射线照射使细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化．称为单向混合淋巴细胞培养(单向MLC)。MLR可通过³ H—TdR掺入率、形态学检查法及MTT法检查反应细胞的增殖能力。MLR主要用于移植前组织配型，也是免疫调节研究中的实验模型。本节介绍单向MLC二方法。

(二)材料

1．供者和受者淋巴细胞悬液，浓度为l×10⁶／ml。

2．丝裂霉素C、³ H—TdR。

3．20％NCS RPMI 1640培养基。

(三)方法

1．刺激细胞的准备 在淋巴细胞悬液内加入丝裂霉素C，最终浓度为25μg／ml，于37℃水浴中作用30min，1000r／min离心10min，弃上清液，沉淀细胞用Hank’s液洗涤3次。

2．反应细胞的准备将分离纯化的淋巴细胞调整细胞浓度为1×10⁶／ml。

3．取刺激细胞和反应细胞各O．2ml，加入1．8 ml  20％NCS RPMI 1640培养基，置37℃、5％C0₂孵育6d。

(四)结果分析

1．形态学方法以转化细胞百分率判断淋巴细胞反应强度，一般认为转化率小于5％为阴性。

2．³ H—TdR掺入法终止培养前20h加入74kBq ³ H—TdR。终止培养后，按照前述增殖实验³ H—TdR掺入法收集细胞测定cpm值，并计算SI。

3．MTT法终止培养前6h加入MTT。培养终止后加酸化异丙醇O．1ml，充分混匀，静置数分钟，按MTT比色法测OD值，并计算SI。

(五)注意事项

1．增殖反应的细胞应保持高活性，一般应大于或等于95％。此外，增殖细胞的浓度过高或过低均不利于细胞生长。

2．丝裂原刺激淋巴细胞增殖时，常需要一定数量的抗原递呈细胞同时存在，否则难以测出细胞的增殖反应。

3．注意无菌操作。

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