人结肠癌细胞SW480的冷冻保存

1)训练目的

掌握细胞冻存的方法及冻存时的注意事项。

2)实验原理

参见本技能操作训练“一”中2)。

3)实验材料

①器材：液氮罐、冻存管(塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶)、离心管、吸管、离心机、一70℃低温冰箱、超净工作台等。

②试剂：0．25％胰酶、培养基(DMEM+10％FBS)、冻存液(血清：DMSO=9：1)。

4)操作步骤

①37℃水浴预热培养基。

②消化细胞。

a．在超净台中，弃培养基，加入2～5 mL PBS清洗细胞后，再加入l mL胰酶消化细胞。

b．显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5 mL培养基终止消化。

c．用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹匀、打散。

③细胞计数：

a．洗净晾干血小板计数板和盖玻片，将盖玻片完全覆盖计数区。

b．充分混匀细胞，取少量(0．1—0．5 mL)细胞悬液与等体积的染色液台盼蓝混合，移液器吹吸混合均匀，用移液器取20止混合液从盖玻片两端(与中间凹槽平行的两端)分别打人细胞，以细胞悬液刚好浸湿盖玻片为佳。

c．显微镜下，数4个计数区的总细胞数，无活性细胞染成蓝色，活细胞不被染色。

d．细胞密度=(细胞总数／4)×10 000x2。

注意：这里10 000是不变的，因为计数的细胞是在体积为10^-4 mL计数池内，将4个计数区的细胞数除以4取平均数，乘以2是补偿加等体积台盼蓝形成的稀释。

e．细胞活性=活细胞数／细胞总数×100％。

注意：当细胞密度高时，可调整细胞悬液和台盼蓝的比例，计数时乘以相应的稀释倍数即可。

f.当细胞密度达到传代密度且细胞活性在90％以上时，可以冻存细胞。

④在超净台中将要冻存的细胞移人离心管，1 000 r／min离心5 min。

⑤弃上清，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×10⁶～l×10⁷个／mL。

⑥将细胞悬液分装到冻存管中，每管l mL。将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

⑦贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。

⑧将装有细胞的冻存管放入程序降温冻存盒，4℃下存放30 min，转放一20℃冰箱4 h，然后放人一70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内(一196℃)。

5)注意事项

①DMSO常温下为液态，4℃冰箱放置时为固态。

②现多用塑料螺口小瓶对细胞进行冻存，使用方便而且不会炸裂，但如喷量不好，有时密封不严，因而使用前要仔细检查，冻存时最好用胶布将瓶口缠绕包紧以防密封不严。如安瓿瓶保存细胞时，需要用火焰将安瓿瓶熔封，熔封时必须保证安瓿瓶完全封闭，同时注意不能使安瓿瓶内细胞悬液的湿度升高；冻存时，首先将安瓿瓶直立放置亍塑科盆或小纸盒中，周围固定，以免倾倒，因为安瓿瓶颈部一般较薄，冻存时易被膨胀的冰挤破；安瓿瓶易炸裂，解冻时注意个人防护。

细胞冻存后，要定期检查液氮数量，如发现液氮挥发一半时要及时补充，补加液氮时要做好眼、手、脚等身体暴露部位的防护以免冻伤。细胞在液氮中储存时间理论上是无限的。但为妥善起见，特别是很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次以观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞，最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。

来源：中国微生物菌种网www.bnbio.com