电子显微镜

由于光学显微镜的分辨率200nm左右，而大部分的细胞器和病毒的直径都要小于200nm，所以开发分辨能力更强的显微工具成了细胞超微结构研究的必然选择。

电子显微镜就是一种根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的超微结构在高放大倍数下仍能产生高分辨率像的仪器。自从1931年德国的克诺尔(Max Knoll)和卢卡斯(Ernst Ruska)发明第一部电子显微镜以来，电子显微镜经过不断改进和发展已成为了细胞生物学研究的重要助手，目前透射电子显微镜(transmissionelectron microscope，TEM)的分辨率已被提高到，0.2nm，而扫描电子显微镜(scanningelectron microscope，SEM)的分辨率也达到了1.2nm，极大地满足了人类对物质超微结构研究的需要。

电子显微镜的成像原理是：当由热阴极发射的电子，在几十至几百万伏加速电压作用下，经聚光镜聚焦成束，以较高的速度投射到很薄的样品上，并与样品中的原子友生碰撞，从而产生散射而改变其运动方向，呈现一立体角发散开来，散射角与样品的密度及厚度有关。“质量厚度”越大，电子散射角亦越大，被样品后面小孔径光阑挡住的电子就愈多，这时像的亮度就愈暗；反之，“质量厚度”较小的样品，其电子散射角较小，穿过光阑孔的电子束就较强，这部分成像时亮度较大，因此，对于不同“质量厚度”的样品部位，在荧光屏上就形成了明暗不同的黑白影像。其特点如下。

①以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的穿透力为：波长与加速电压(50～120kV)的平方根成反比。穿透力较弱。

②由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。

③分辨率0.2nm，放大倍数可达百万倍(10⁶)。

④用于观察超微结构(ultrastructure)，即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构(submicroscopic structures)。

(一)透射电子显微镜

利用电子枪发出的高速电子束照射超薄的生物样品，透射电子流经电磁透镜的多级放大后成像的仪器。由于样品各部分对入射电子有不同的散射度，故可在荧光屏上形成不同的电子密度的放大图像，用来观察样本细胞内部结构。

1．透射电子显微镜工作原理

电子束通过标本时，根据标本各部位密度的不同。部分电子发生散射，只有剩余的电子或像，经物镜和投射镜放大后投射到照相底片或荧屏上。由于散射的电子不参加成像，故标本中密度大的部分成像后形成电子流量减少的暗区；相反密度小的部分散射电子少而形成明区。

2．透射电子显微镜制样技术

(1)超薄切片：电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机制作。通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属(铀、铅)盐染色。

(2)负染技术：用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨率可达1.5nm左右。

(3)冰冻蚀刻(freeze—etching)：亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸气碳和铂，然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜(replica)。

(二)扫描电子显微镜

扫描电子显微镜(SEM)是在反射式电镜基础上发展起来的，是电子显微镜技术发展史上一项新的成就。于20世纪60年代问世，用来观察样品表面的形貌特征。

1．扫描电镜的工作原理

是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。

2．扫描电镜的特点

具高的分辨率，目前扫描电镜的分辨本领可达到或优于3～6nm，景深大，无需特殊复杂处理就可观察较大较厚的样品，图像富有立体感和真实感；放大倍率广，样品适应性大，适用范围广；样品制备简单(主要包括取材、清洗、固定、干燥、镀膜几个步骡，无需进行透射电镜中超薄切片制作及染色的相关步骤)。

(三)扫描隧道电子显微镜

1981年，IBM公司苏黎世研究室的Gerd Binnig和HeinrichKohrer研制出了扫描隧道电子显微镜(STM)，并因此荣获1986年诺贝尔物理学奖。

在扫描隧道电子显微镜中，“光阑”是一根极小的钨探针，其尖端已磨得非常之细，可能只相当于1颗原子，其宽度仅0.2mm。通过压电控制装置，可使探针尖端移动到距一个导电样品表面1nm或2nm的范围内，使探针尖端上那颗原子的电子云与样品表面上距探针尖端最近的原子的电子云发生重叠，如果在探针尖端加一个小电压，电子就会通过隧道效应穿过尖端与样品表面间的空隙产生一股微细的隧道电流。如果探针的高度保持不变，由于样品表面的微小突起变化，那么当探针沿样品表面运动时隧道电流就会剧烈变化。实际上，探针是随着样品表面的起伏而不停地做上下运动的，由一个反馈机构探测出隧道电流的变化，并使加在纵轴上的控制装置的电压相应地改变，这种变化可通过电子装置转化为一幅表示样品表面起伏变化的图像。如果探针非常尖，压电控制装置的精确度非常高，且各扫描行的间距非常近，则理论上可从扫描隧道电子显微镜的图上可以看出单个的原子，其直径可以小到只有0.2nm。对于气态、液态和固态的物质均可进行观察，即探测微观世界物质表面形貌特征。

(四)原子力显微镜

由于扫描隧道电子显微镜要求的样品是导体，有一定的局限性，Binning在STM的基础上发展了原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)。这种显微镜最重要的改进就是不再要求样品是导电体，可以用来研究包括绝缘体在内的固体材料表面结构。其原理是将一个对微弱力极端敏感的微悬臂的一端固定，另一端连接的微小针尖接近样品，这时它将与其相互作用，作用力将使得微悬臂发生形变或运动状态发生变化。通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质。

相对于扫描电子显微镜，原子力显微镜可以提供真正的三维表面图。同时，不需要对样品进行任何特殊处理，如镀铜或碳，不会对样品造成不可逆转的伤害。原子力显微镜在常压下甚至在液体环境下都可以良好工作，而一般的电子显微镜都需要在高真空的条件下运行。这样可以用来研究生物宏观分子，甚至活的生物组织。

和扫描电子显微镜(SEM)相比，AFM的缺点在于成像范围太小，速度慢，受探头的影响太大，而且分辨率低于SEM。

随着科学技术的发展，生命科学开始向定量科学方向发展。核酸和蛋白质的结构及其相关功能的关系成为大部分实验的研究重点。因为AFM的工作范围相对较宽，可以在自然状态(空气或者液体)下对生物医学样品直接进行成像，分辨率也比较高。因此，AFM已成为研究生物医学样品和生物大分子的重要工具之一。

来源：中国微生物菌种网 www.bnbio.com