细胞组分的分析方法

将细胞形态的观察与细胞组分的分析有机结合是细胞生物学研究的一个重要方面。其主要目的是为了解释生物大分子在细胞内的相互关系以及功能。

为了进一步对细胞中的各种细胞器的结构、功能和物理化学性质进行研究，提取、分离细胞组分是不可缺少的技术手段。细胞组分的分级分离包括组织匀浆和细胞组分的分离两个内容。组织匀浆的原理是在能保持细胞活力的低温条件下，用快速的机械或超声波方式使细胞膜破裂，让细胞内亚细胞组分逸出，细胞组分经匀浆释出后。常依据其不同的沉降系数和在匀浆介质中的密度，用离心的技术来加以分离。

离心的原理是利用离心机产生的强大离心力来分离不同沉降系数的物质或颗粒。

根据离心速度的不同，通常可分为普通离心、高速离心和超高速离心。0～4000r／min为普通离心，通常用来分离细胞和大的细胞器；4000～20000r／min为高速离心,可用来分离和分析亚细胞组分和生物大分子；20000～80000r／min为超高速离心，也称超速离心，是纯化和分析生物大分子及亚细胞组分的最有用技术之一，如做氯化铯密度梯度离心纯化质粒DNA分子。根据离心管的位置，可划分为角度转头离心、水平转头离心、垂直转头离心。根据离心力方法的不同，有差速离心和密度梯度离心之分。

(一)差速离心

差速离心是指低速与高速离心交替进行，利用不同的离心速度所产生的不同离心力，使各种沉降系数不同的颗粒先后沉淀下来，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开，达到分离的目的。沉降系数差别在一个或几个数量级的颗粒，可以用此法分离。此法较简单，离心时，根据不同样品，选择好转速与时间，待沉降系数大的组分沉淀下来后，让上清液再在更高的转速下离心以沉淀沉降系数小的颗粒。差速离心是分离细胞器(如细胞核、线粒体、高尔基体)及各种大分子基本手段。转速>25000r／min，离心力>89kg者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100000r／min，离心力超过500kg。

(二)密度梯度离心

密度梯度离心也称区带离心，它是用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，离心后不同密度的颗粒沉降到与其密度相同的位置停止沉降，从而聚集成区带，达到彼此分离的目的。此法具有分辨率好、抗对流强、样品稳定等优点。

密度梯度离心包括两种类型：①速率密度梯度离心；②等密度梯度离心。常用的分离介质为：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。在分离活细胞时对介质有一些特殊的要求，即：①能产生密度梯度，且密度高时，黏度不高；②pH中性或易调为中性；③浓度大时渗透压不大；④对细胞无毒。

1.速度密度梯度离心

速度密度梯度离心是把样品铺放在一个连续的或不连续的液体密度梯度中，用此梯度涪作为颗粒沉降的介质。颗粒的沉降速度取决于其大小、形状、密度，也取决于离心力以及介员的密度和黏度，所以沉降速度差为20％或差别更小的颗粒可以用这一方法毫无困难地分离。可以说，速率密度梯度离心法在一次离心过程中实现了几次多级差速离心的过程，扩大了差速离心法的分离范围。

速度密度梯度离心的特点是：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒能最小密度；介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。

速度密度梯度离心常用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器，且可以分离从细脆到各种大分子颗粒的组分。

2．等密度梯度离心

等密度梯度离心与分离颗粒的大小无关，而与它们的密度有关，它是一种测定生物物质颗粒的浮力密度的静力学方法。离心开始前，把样品加在密度梯度溶液的上层或均匀分布在梯度溶液中，梯度可预先制成或让其在离心时自然形成。离心后，离心管底部的密度大于生物物质的密度，而上部的密度则小于它，生物物质向着离心管内部梯度中相当于其本身浮力密度的某个位置移动，最终达到与自己密度相同的液体层次处，再离心也不再有位置的变化(这也是等密度梯度离心与速率密度梯度离心的区别之一)，每种生物物质形成一条狭窄的带．从而将不同密度的成分分离。

等密度梯度离心的特点是：介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度；所需的力场通常比速率沉降法大10～100倍，往往需要高速或超速离心。等密壁梯度离心中，经常使用的梯度材料是氯化铯，因为氯化铯溶液在离心力场(通常为超速离心力)作用下能形成一连续的密度梯度。

等密度梯度离心常用来分离密度不等的颗粒，样品组分密度差在0.05即可用等密度撵度离心来分离提纯，如果用超离心，即可检测分辨密度差在0.001的组分，样品一次离心即能得到分离、提纯。

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