工业微生物菌种的保藏—液氮超低温保藏法

     液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温(一196℃)下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。美国典型培养物收藏中心(ATCC)菌种保藏中心采用该法时，把菌悬液或带菌丝的琼脂块经控制制冷速度，以1℃／min的下降速度从O℃直降到一35℃，然后保藏在一196～一150℃液氮冷箱中。如果降温速度过快，由于细胞内自由水来不及渗出胞外，形成冰晶就会损伤细胞。据研究认为，降温的速度控制在(1～10)℃／min，细胞死亡率低；随着速度加快，死亡率则相应提高。液氮低温保藏的保护剂，一般是选择甘油、二甲基亚砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊环、吐温一80等，但最常用的是甘油(10％～20％)。不同微生物要选择不同的保护剂，再通过试验加以确定保护剂的浓度，原则上是控制在不足以造成微生物致死的浓度。

     此法操作简便、高效，保藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。除了少数对低温损伤敏感的微生物外，该法适用于各种微生物菌种的保藏，甚至连藻类、原生动物、支原体等都能用此法获得有效的保藏。此法的另一大优点是可使用各种培养形式的微生物进行保藏，无论是孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可采用该保藏法。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。

     要使用菌种时，从液氮罐中取出安瓿瓶，并迅速放到35～40℃温水中，使之冰冻融化，以无菌操作打开安瓿瓶，移接到保藏前使用的同一种培养基斜面上进行培养。从液氮罐中取出安瓿瓶时速度要快，一般不超过1 min，以防其他安瓿瓶升温而影响保藏质量。并且取样时一定要戴专用手套以防止意外爆炸和冻伤。在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保藏法、石蜡油封藏法最为简便，砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效果最好。应用时，可根据实际需要选用。对于发酵工业中常用的基因工程菌，为了防止其质粒丢失、非同源重组或其他退化现象，常用甘油悬液保藏法，也可在斜面上进行保藏，但保藏时必须在培养基中加入一定浓度的抗生素或其他的选择压力，以保持菌种的稳定性。

     ATCC仅采用2种最有效的保藏法，即保藏期一般达5～15年的冷冻真空干燥保藏法与保藏期一般达15年以上的液氮超低温保藏法，以达到最大限度地减少传代次数，避免菌种变异和衰退的目的。我国菌种保藏多采用3种方法，即斜面低温保藏法、液氮超低温保藏法和冷冻真空干燥保藏法。