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病毒的培养
2378 人阅读发布时间：2016-05-30 14:40
病毒是严格细胞内寄生的微生物，必须以活细胞进行培养，故应根据病毒种类选择相应的细胞、鸡胚或敏感动物进行病毒的培养与鉴定。在做烈性病毒性传染病标本培养时，必须在生物安全实验室内，严格遵循无菌操作和生物安全防护原则。
(一)细胞培养
病毒与细胞间关系有严格的选择性，有的病毒可在多种细胞中增殖，有的细胞适用于多种病毒增殖，这取决于细胞对病毒的敏感性。用于培养病毒的细胞有原代细胞、二倍体细胞和传代细胞系(表3．1)，由于其不同特性，往往应用于不同目的。
1．原代细胞培养新鲜的组织或器官，在胰蛋白酶作用下先制成单个细胞悬液，在充足的营养条件下，经37℃数天培养后形成的单层细胞层，称原代细胞培养。原代细胞较好保有原有组织特性，对病毒最为敏感，常用于直接从标本中分离病毒，如原代猴肾细胞是培养正黏病毒、副黏病毒、肠道病毒和腺病毒的常用细胞，但制各较为复杂。
2．二倍体细胞培养原代细胞在体外分裂50代后仍保持染色体的二倍体特征，属正常细胞，称为倍体细胞株。但这类细胞不能无限制的连续传代，多次传代后也会出现细胞老化，敏感性降低。常用的二倍体细胞有人胚肺、人胚肾、猴肾、地鼠肾细胞等，人类许多病毒易感，广泛用于病毒分离和疫苗制各。如人胚肺细胞wI．38，可用于VZV、腺病毒和巨细胞病毒的分离。
来源：北纳微生物菌种网:http://www.bnbio.com
3．传代细胞培养来源于肿瘤细胞或二倍体细胞株传代过程中的变异细胞，具有瘤细胞特性，繁殖率高，可无限传代。常用人宫颈癌细胞(Hela)、传代地鼠肾细胞(BHK21)、人喉皮癌细胞(Hep．2)、传代非洲绿猴肾细胞(Vero)等。由于源自肿瘤细胞，不宜用于疫苗的制各，但对很多病毒的敏感性高且稳定，可长期存活，生长旺盛，故常用于病毒的分离鉴定、病毒抗原的大量生产和抗病毒药物筛选研究。如可用Hela和Vero分离单纯疱疹病毒等。
(二)鸡胚培养和动物接种
1．鸡胚培养具有广泛易感性，收获物中富含病毒，结果易判断，条件易控制，且来源充足，操作简单，适于病毒分离、疫苗生产、抗原大量制备、抗病毒药物研究等。流感病毒、疱疹病毒、痘病毒等均可用鸡胚分离(表3．2)。一般采用9～12日龄鸡胚，按病毒种类选择接种部位：①羊膜腔接种：用于从临床材料(如患者咽漱液)初次分离流感病毒等，这种接种途径在羊水和尿囊液中均可收获病毒；②绒毛尿囊膜接种：用于痘病毒和单纯疱疹病毒的分离，这些病毒在绒毛尿囊膜上可形成肉眼可见的斑点状或痘疱状病灶，感染性病毒颗粒的数目可以通过产生的斑或痘数目来计算，因此该方法还可用于抗病毒血清滴定试验，即在有抗体存在的情况下，痘疱形成受到抑制；⑧尿囊腔接种：用于流感病毒、腮腺炎病毒和
新城疫病毒的分离和传代培养，病毒可在内皮细胞中复制，复制的病毒被释放到尿囊液中，因此，尿囊液可收获大量病毒；④卵黄囊接种：用于某些嗜神经病毒培养。病毒主要在卵黄囊的内皮细胞生长，可分离流行性乙型脑炎病毒。
2．动物接种动物接种是病毒分离最早使用的方法，现逐渐被细胞培养所代替，但在某些病毒仍用此方法。常用动物为豚鼠、家兔、猴、小自鼠和大白鼠等。动物的选择应考虑其对病毒的易感性、动物的健康状况、大小、性别和品系等。接种部位亦随病毒种类而异，可有脑内、鼻内、皮内、皮下、腹腔、静脉接种等。如用出生24～48小时内的乳鼠分离柯萨奇病毒，用小鼠脑内接种流行性乙型脑炎病毒、登革热病毒和出血热病毒。接种后，每日观察和记录动物发病情况，若动物濒临死亡，则在死亡前取病变组织继续传代与鉴定。
来源：北京标准物质网www.biaowu.com
(一)细胞培养
病毒与细胞间关系有严格的选择性，有的病毒可在多种细胞中增殖，有的细胞适用于多种病毒增殖，这取决于细胞对病毒的敏感性。用于培养病毒的细胞有原代细胞、二倍体细胞和传代细胞系(表3．1)，由于其不同特性，往往应用于不同目的。
1．原代细胞培养新鲜的组织或器官，在胰蛋白酶作用下先制成单个细胞悬液，在充足的营养条件下，经37℃数天培养后形成的单层细胞层，称原代细胞培养。原代细胞较好保有原有组织特性，对病毒最为敏感，常用于直接从标本中分离病毒，如原代猴肾细胞是培养正黏病毒、副黏病毒、肠道病毒和腺病毒的常用细胞，但制各较为复杂。
2．二倍体细胞培养原代细胞在体外分裂50代后仍保持染色体的二倍体特征，属正常细胞，称为倍体细胞株。但这类细胞不能无限制的连续传代，多次传代后也会出现细胞老化，敏感性降低。常用的二倍体细胞有人胚肺、人胚肾、猴肾、地鼠肾细胞等，人类许多病毒易感，广泛用于病毒分离和疫苗制各。如人胚肺细胞wI．38，可用于VZV、腺病毒和巨细胞病毒的分离。
来源：北纳微生物菌种网:http://www.bnbio.com
3．传代细胞培养来源于肿瘤细胞或二倍体细胞株传代过程中的变异细胞，具有瘤细胞特性，繁殖率高，可无限传代。常用人宫颈癌细胞(Hela)、传代地鼠肾细胞(BHK21)、人喉皮癌细胞(Hep．2)、传代非洲绿猴肾细胞(Vero)等。由于源自肿瘤细胞，不宜用于疫苗的制各，但对很多病毒的敏感性高且稳定，可长期存活，生长旺盛，故常用于病毒的分离鉴定、病毒抗原的大量生产和抗病毒药物筛选研究。如可用Hela和Vero分离单纯疱疹病毒等。
(二)鸡胚培养和动物接种
1．鸡胚培养具有广泛易感性，收获物中富含病毒，结果易判断，条件易控制，且来源充足，操作简单，适于病毒分离、疫苗生产、抗原大量制备、抗病毒药物研究等。流感病毒、疱疹病毒、痘病毒等均可用鸡胚分离(表3．2)。一般采用9～12日龄鸡胚，按病毒种类选择接种部位：①羊膜腔接种：用于从临床材料(如患者咽漱液)初次分离流感病毒等，这种接种途径在羊水和尿囊液中均可收获病毒；②绒毛尿囊膜接种：用于痘病毒和单纯疱疹病毒的分离，这些病毒在绒毛尿囊膜上可形成肉眼可见的斑点状或痘疱状病灶，感染性病毒颗粒的数目可以通过产生的斑或痘数目来计算，因此该方法还可用于抗病毒血清滴定试验，即在有抗体存在的情况下，痘疱形成受到抑制；⑧尿囊腔接种：用于流感病毒、腮腺炎病毒和
新城疫病毒的分离和传代培养，病毒可在内皮细胞中复制，复制的病毒被释放到尿囊液中，因此，尿囊液可收获大量病毒；④卵黄囊接种：用于某些嗜神经病毒培养。病毒主要在卵黄囊的内皮细胞生长，可分离流行性乙型脑炎病毒。
2．动物接种动物接种是病毒分离最早使用的方法，现逐渐被细胞培养所代替，但在某些病毒仍用此方法。常用动物为豚鼠、家兔、猴、小自鼠和大白鼠等。动物的选择应考虑其对病毒的易感性、动物的健康状况、大小、性别和品系等。接种部位亦随病毒种类而异，可有脑内、鼻内、皮内、皮下、腹腔、静脉接种等。如用出生24～48小时内的乳鼠分离柯萨奇病毒，用小鼠脑内接种流行性乙型脑炎病毒、登革热病毒和出血热病毒。接种后，每日观察和记录动物发病情况，若动物濒临死亡，则在死亡前取病变组织继续传代与鉴定。
来源：北京标准物质网www.biaowu.com