真核细胞表达系统

常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。

1.酵母表达系统 最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。

2.昆虫细胞表达系统 杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。

3.哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。

哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。常用质粒表达载体如pcMVp-NEO-BAN、pEGFP等，都以pCMV启动子驱动外源真核蛋白高水平地稳定表达，由于载体有Neo抗性基因，转染细胞后用G418筛选，可建立稳定高效表达的细胞系。哺乳动物细胞表达常用的宿主细胞有COS、CHO、BHK、NIH3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质糖基化有不同的影响，因此选择宿主细胞时应根据具体情况而定。根据不同实验目的，蛋白质可以进行瞬时表达、稳定表达或者一定条件下诱导表达。

(1)瞬时表达：通常可以使蛋白在细胞中暂时表达数天到数周。瞬时表达常用于验证cDNA是否能够指导蛋白的合成，比较表达同一蛋白的不同载体的有效性，在进行建立稳定转染的细胞系之前，通过瞬时表达来验证重组表达载体的正确性是十分必要的。然而，瞬时表达难以按比例产生大量蛋白质(>1mg)，此外，整个细胞群体中只有部分细胞暂时得到蛋白表达，不利于细胞表型的研究。

(2)稳定表达：通过利用共转染的标记筛选系统，如G418等，对DNA转染后的哺乳动物细胞进行选择，使质粒DNA稳定整合到宿主细胞染色体上，则可以获得无限表达所需蛋白的稳定转染细胞系。

(3)诱导表达：可诱导表达系统使外源基因的表达受诱导刺激强度控制，避免持续稳定表达某些蛋白带来的细胞毒性，最常用的是四环素(tetracyrcline，tet)调控的可诱导表达系统，具有严密、高效、可控制性强的优点。该系统由调节质粒和反应质粒组成，有两种调节方式：①tet-off，四环素存在时外源基因表达受抑制，而去除四环素后诱导基因表达；②tet-on则相反，培养基中有四环素时表达外源基因，无四环素时基因表达受抑制。tet-on系统更容易操作，避免诱导蛋白时清洗四环素的步骤，由于普通血清含有四环素而容易诱导不必要的蛋白表达，因此tet-on细胞需要在无四环素的血清中培养。

除了质粒表达载体以外，病毒介导的基因转移也是将外源DNA引入不同类型细胞的有效而方便的方法，痘苗病毒是常用系统之一。痘苗病毒载体中必须表达cDNA而不是基因组克隆，病毒在感染后6小时开始形成，一直持续2天。痘苗病毒表达系统能表达多个蛋白或表达多亚基酶的几个亚基，例如，含有不同cDNA的DTM-1载体可以共转染到表达噬菌体T7聚合酶的细胞中以研究多种蛋白的表达，对研究多亚基蛋白复合物的组织尤其有用。