物样品的采样、收获、加工和储存

　　【来源/作者】北纳创联 

　　青饲料

　　为获得植物样品，实际农业操作中，对两次施药的情况，在第2次喷药,后第6天第1次采集叶类样品(1997一06—19)。这时的样品还是青秸秆，属于BBCH中的69阶段(青秸秆)。小麦植株从地表面齐根切断作为待测样品。收获的植株切成1cm的小段，称重。然后将样品经液氮冷冻后磨碎(Ultra—Turrax T 50，Janke und Kulakel)混匀。10～112g植株样品保存于-20℃条件下。

　　干饲料

　　第2次喷药后第26天(1997一07一09)，即蜡熟初期(BBCH 83)收集干饲料样品，采样和储存过程同青饲料(4．2．1)。

　　秸秆和麦粒

　　第2次施药后第48天收获，将麦穗从麦秆上剪下作为收获期样品，剩下的茎部分从地表面齐根剪下，加工成青饲料(4．2．1)。

　　将麦粒剥出、称重。液氮冷冻后磨碎(ultra—Turrax T 50，Janke Lmd KLmkel)。剩下的麦麸混入秸秆，加工成青饲料(4．2．1)。

　　提取和分馏

　　提取过程中加入1mg／mL的半胱氨酸盐酸盐溶液以防止F64的氧化降解，使用旋转蒸发仪在35℃条件下，对样品进行浓缩。当提取溶剂是CH2C12时，提取液浓缩前先加入少量乙腈(约15mL)。进样分析前，先将样品离心以去除沉淀物(如半胱氨酸盐酸盐)。最后的样品溶液保存于4℃或一20℃，并编号(如PC)4004ES)。

　　经常规方法提取后的残留物，再经加速溶剂萃取(ASE)。第1阶段的提取试验包括在每一次采样日期的1个月内，四个初级农产品(ID代码始于PO4002)提取后经薄层层析法分析。这些初级萃取物质中代谢模式比较见图1。这些萃取物也用于储藏稳定性监测。

　　青饲料

　　降解实验：20g均一的小麦秸秆经3×100mL(乙腈／水=80／20)均质提取后(ultra Turrax homogenisc)r)，真空抽滤过上层有10g硅藻土的过滤器(type：black ribbon，Schleicher Lmd Schuell，Germany)。

　　合并抽滤液并取出10mL(PC)4008EF)，待色谱方法分析。

　　用ASE萃取样品1以加速溶剂萃取：

　　将常规方法提取后的青饲料与硅藻土@(Mereck，Darmstadt，Germa—ny)混匀后装入33 mLASE萃取池，在50℃和100℃条件下各提取两次，所用萃取设备为．ASE 200萃取仪(Dionex，Idstein，Germany)。

　　合并乙腈／水提取液(300mL，PO4008EF、)，真空浓缩(35℃)至只剩水相(61mL)。

　　在该水相中加入cH2c12(3×60mL)进行液液分配，分离出水相(60mL，P04008HF)后，将CH₂C1₂相浓缩(PO4008IF)。空气吹干过滤相样品1，用LSC对每相三等份进行放射性测量，对5等份样品1混合并进行放射性测量俘获¹⁴CO₂的量。

　　提取步骤流程见图2(未给出)，定量结果见附录5。

　　干麦秆

　　提取步骤见图3(未给出)。20g均一干麦秆在乙腈／水=80／20的提取液中浸泡，分3次进行，所用提取液体积大概250mn。

　　提取后的秸秆与硅藻土混合后(2：1)，ASE再次提取。

　　合并两种提取方法的提取液，浓缩到只剩水相后，CH₂Cl₂液液分配，接下来的步骤同青饲料。

　　干饲料样品2在二嘿英jHCl中的酸性水解(PO4006CH)

　　5g干饲料样品2经二嘿英／2N HCl(v：v一9：1.45mL。)回流提取2h，抽滤后，干饲料样品再经60ml。水洗涤。浓缩后的样品经LSC和TLC测定放射性，5等份的剩下样品3经低压升华干燥后燃烧测定闪烁液中俘获¹⁴CO₂放射性。

　　麦秆

　　秸秆样品(4．2．3)中的待测物同样采用乙腈／水=80／20提取，取样量为20g，提取液体积大概为200mL，分3次进行。

　　提取后的秸秆与硅藻土混合后(2：1)，ASE再次提取，提取条件同干饲料。合并所有提取液，浓缩到只剩水相后，CH2Cl2液液分配，接下来的步骤同青饲料。

　　秸秆样品2在二吧英／HCl中的酸性水解：

　　5g秸秆样品2经二唾英／2N HCl(v：v一9：1，45mI．)回流提取2h，抽滤后，秸秆样品再经60mI。水洗涤。浓缩后的样品(二嚷英／2N HCl样品IDs：P04037CS，水相样品：PO4037[IS)经LSC和TLC测定放射性，等份的剩下样品3经低压升华干燥后燃烧测定闪烁液中俘获¹⁴CO₂放射性。

　　为了分离鉴定代谢物，取样200g重新提取。样品过夜提取后(4℃)，使用80％乙腈提取液提取4次，然后按青饲料后续步骤进行。浓缩后的水相经CH2Cl2液液分配3次(有机相浓缩后记为相I：P04004HS)，残余水相再经正丁醇液液分配3次(有机相浓缩后记为相Ⅱ：P04004HS)，剩余水相2记为PO4004JS。

　　麦粒

　　提取步骤见图5，定量结果见附录7。50g麦粒(P04001CG)，经乙腈和水[80／20(v／v)]混合提取3次，每次150mL，后续步骤同青饲料。

　　所有上清提取液浓缩后，剩余水相(81mL)经CH2Cl2(3×80mL)液液分配后，浓缩有机相记为PO40091G，水相记为PO4009JG。

　　麦粒样品1自然风干后测定放射性。

　　ASE提取：

　　将常规方法提取后的麦粒1(P040091)G)22g与11g硅藻土(Metck，Darmstadt，Gemany)混匀后进行ASE：萃取，提取条件参照干饲料的提取。

　　麦粒样品2自然风干后，用LSC测定燃烧后的放射性。

　　淀粉酶(a一淀粉酶)酶解：

　　利用淀粉酶水解反应提取麦粒1中的待测物。100mg淀粉酶(Merck no,3604)溶于含有10mg．NaN₃的55mL柠檬酸盐／NaOH的缓冲溶液(pH6，Fixanal；Riedel de Haen，no．38745)。将上述溶液加入装有麦粒样品的玻璃容器中，室温下搅拌9d。在第2天、3天、4天、7天和9天，取出上层溶液抽滤。由容器中所剩麦粒质量和原质量的差值可得溶液中的麦粒质量。未溶解的固体重新浸入新配制的酶解液中，供后续取样，取样5次后，完全燃烧后(Pc34012BG)剩余固体质量(solids 3)为0．81g。

　　合并所有液相缓冲溶液(PO4012AG)并取出部分和solids 3做放射性测定。

　　麦粒样品1在二嘿英／HCl中的酸性水解(P()4009I)G)：

　　5g麦粒样品l PC)4009DG经二呼英／2N HCl(v：v一9：1，4 4mL)回流提取2h(P04011AG)，抽滤后，剩余固体可完全溶解于水中，所以水解处理后没有固体剩余(P04011BG)。

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