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黄孢原毛平革菌原生质体的制备与再生
1191 人阅读发布时间：2016-09-08 11:51
【来源/作者】北纳创联
1. 菌种
黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)BKM—F一1767，购自广东微生物研究所。
2. 培养基
基本培养基：200g马铃薯浸出液，20g葡萄糖，3gKH2PO4，1．5gMgSO4 ·7H2O，0．1mg FeSO4·7H2O，0．2mg CuSO4·5H2O，8mg维生素B1。用水定容到1000mL。
斜面孢子培养基：采用改良PDA培养基(L-1)，4％山梨醇，200g马铃薯浸出液，20g葡萄糖，20g琼脂，3gKH2PO4，1．5g MgSO4·7H2O，0．1mg FeSO4 ·7H20+0，2mg CuSO4·5H20，8mg维生素Bl。
以上培养基使用前0．07MPa湿热灭菌20min。
3. 生化试剂
蜗牛酶、山梨糖、山梨醇、Novonzyme234为Sigma公司产品。溶壁酶购自广东微生物研究所。其余试剂均为国产分析纯试剂。
4. 原生质体形成率、再生率计算
原生质体形成率 = ( A — B ) ／ A × 100％
原生质体再生率 = ( C — B ) / ( A — B ) × 100％
A：未经酶处理的菌液在固体培养基平板上，28℃培养7d生长的菌落数。
B：经酶处理后的菌液在固体培养基平板上，28℃培养7d生长的菌落数。
C：经酶处理后的菌液在高渗再生培养基平板上，30℃培养3d生长的菌落数。
5. 原生质体的制备
黄孢原毛平革菌在基础培养基平板上培养8d，用无菌水洗一下平板中的分生孢子，经4层擦镜纸过滤，接种于100mI。的基础培养基中，使其孢子的浓度为1×106个／mL左右，在36℃下振荡培养5～6h，孢子会萌发出极短的芽管。移1mL菌液于离心管内，10000r／min离心5min收集萌发孢子，用0．6 mol/LMgS04洗3次，重悬于1mL酶液中(酶液的配制为2mL/MgSO4溶液中含有溶壁酶14mg和NovoNzyme234各10mg(比例为1．4／1))，置于37℃下培养，每30min镜检一次+仔细观察原生质体形成情况。一般需要2h左右，原生质体的形成率即可达85％以上，用O．6mol/LMgS04；洗2次，重新悬浮于1mol/LMgS04溶液中，以备融合时使用。
实验结果表明，黄孢原毛平革菌原生质体的形成率为85％，黄孢原毛平革菌原生质体的再生率为9％。黄孢原毛平革菌在120min时的酶解扫描照片如图5—7所示。
6. 原生质体形成结果与探讨
（1）原生质体细胞来源的选择
原生质体转化法是丝状真菌最常用的一种遗传转化方法。在这些研究中，研究者们常常采用不同营养状态的细胞作为原生质体的来源，一般均视实验的方便而定。根据已有的报道，P．chrysosporiun原生质体大多来自担孢子，但是根据本来在探索性实验中的结果，利用孢子制备原生质体效果不好，与已有文献中的结果差别很大。另外，也有使用幼嫩菌丝体制备原生质体的报道。国际上仅有Tien等报道，使用分生孢子制备原生质体，但形成率仅为40%。
实验结果发现，萌发的分生孢子细胞壁比幼嫩菌丝的容易被裂解，而分生孢子细胞壁几乎不能被消化。因此萌发的分生孢子是制备原生质体的理想材料，其中最佳的分生孢子萌发率对制备原生质体是至关重要的。
（2）渗透压稳定剂对原生质体形成的影响
制备原生质体常用的渗透压稳定剂有KCl，MgCL2，MgSO4，NaCl和山梨醇、蔗糖，各稳定剂种类及其使用浓度因菌株的不同而不同。实验结果表明，O．6 mol/LMgS04；为渗透压稳定剂，采用舍适的细胞壁裂解酶，黄孢原毛平革菌原生质体的形成率较高，且不易破裂，稳定效果好，因此是制备黄孢原毛乎革菌原生质体较为理想的渗透压稳定剂。
（3）细胞壁裂解酶系的选择
目前有多种细胞壁裂解酶可用于丝状真菌原生质体的制备，最常用的且对多种丝状真菌均较合适的是Novozyme234。在已有的报道中，该酶可单独使用，也可与其他酶类混合使用，后者效果更好。实验研究表明，同时使用Novozyme234和溶壁酶(各lOmg／mL，)，在0．6mol／LMgSO4；中，原生质体的形成率可达85％以上。
（4）原生质体再生条件的研究
原生质体再生，重建细胞壁、恢复完整的形态，是原生质体遗传转化和原生质体融合育种的必要条件。影响其再生频率的因素较多，主要与再生培养基成分、再生培养条件、原生质体制备条件以及菌株本身的特性等有关。本人在实验研究中使用Novozyme234和溶壁酶混合液消化萌发的分生孢子，以O．6 mol/LMgS04作为制备黄孢原毛平革菌原生质体的渗透压稳定剂．得到了比较理想的结果。