放线菌素D诱导肾细胞凋亡实验结果讨论

<肾细胞>

讨论

细胞凋亡是指在一定生理和病理情况下机体为维持内环境稳定, 通过基因调控而使细胞主动有序的消亡过程, 是多细胞生物的一种生理性细胞死亡。细胞凋亡在维持组织、器官的正常生理功能和形态方面起着非常重要的作用, 它可由细胞内部因素和外部刺激所诱导。病毒感染宿主细胞后, 一方面宿主细胞可利用细胞凋亡清除病毒感染的细胞, 加速感染细胞的死亡, 继而能限制病毒的复制和传播, 可能是机体防御病毒侵入的机制之一; 另一方面病毒基因的表达启动相应信号传导途径抑制或延迟被感染细胞发生凋亡。近年来, 对于细胞凋亡的研究已成为医学界的关注热点。Vero细胞作为最常见的真核细胞, 具易培养、易感染、易转染等特点, 广泛用于外源基因的表达、病毒培养及疫苗的制备。 ActD作为常见的凋亡诱导剂, 其作用范围广、诱导效率高等特点, 被广泛用于细胞凋亡的诱导。

目前, 在基础研究中对各种细胞诱导凋亡的浓度和条件国内外尚无统一标准, 但对细胞凋亡模型的建立, 一般采用凋亡率为30%左右作为模型创建良好的标志之一, 因为30%左右的细胞凋亡率既不至于导致细胞死亡率过高, 也保证了药物对凋亡细胞药理作用的发挥。

本研究通过MTT法确立Vero细胞在各个不同终浓度ActD作用不同时间下细胞的存活率; 采用 Annexin V/7-AAD双染法流式细胞术检测了不同浓度ActD作用Vero细胞不同时间后细胞的的凋亡率情况。Giemsa染色显示, 正常细胞核被染成蓝紫色, 呈圆形, 细胞质淡染, 而诱导凋亡的细胞细胞表面皱缩、染色质凝聚在细胞中央、细胞核固缩碎裂成数个圆形颗粒等凋亡现象。

Hoechst33258荧光染色显示, 1mg/L ActD诱导Vero细胞凋亡36 h后, 在凋亡诱导组中可以很明显的看到凋亡小体和致密浓染的颗粒块状荧光, 正常对照组中荧光较淡, 无凋亡小体和致密的浓染现象。本研究用ActD诱导Vero细胞凋亡模型中, 通过MTT法测得1 mg/L ActD作用Vero细胞后, 细胞存活率为(0.55±0.01)。通过流式细胞术得在该条件下细胞凋亡率为(34.83±1.13)%, 建立了ActD 诱导Vero细胞凋亡的模型, 综合考虑细胞存活率和凋亡率两方面因素, 确定其最优条件为: ActD终浓度1 mg/L, 诱导时间为36 h。在此条件下, caspase-3、 caspase-8较对照组升高, 且差异有统计学意义, caspase-9活性基本不变。综上所述, 本实验首次建立了不同浓度ActD诱导Vero细胞凋亡的模型, 为进一步探讨凋亡相关的目的基因在Vero细胞中表达及其作用机制的研究提供实验基础。

 

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