电镜标本的制备

    从20世纪50年代起，电子显微镜在医学及生物学中应用逐渐增多，在促进分子生物学、细胞生物学、组织学以及病理学的发展上起了不可替代的作用。就胶质瘤而言，目前对体外培养的细胞系和来自临床或实验动物组织标本的超微结构已有较为详尽的描述，然而对胶质瘤干细胞的超微结构知道的却不多，这与肿瘤干细胞研究得较晚有关。庆幸的是，笔者所在的课题小组在对胶质瘤干细胞系统研究时搭建的实验平台，使观察其超微结构成为可能。由于细胞取材和电镜切片包埋技术的限制，镜下观察到的不尽是干细胞，还包含祖细胞，故以下称胶质瘤干/祖细胞（gliomastemcels/progenitor，GSCP）。其特征是：在球体中，细胞与细胞间存在不成熟的连接。单个GSCP的细胞膜的形状是凹凸不平的皱褶，突起的那部分为微绒毛；胞质中的核糖体、线粒体、高尔基体比较发达；内质网却短小、稀疏，发育欠佳；微丝和微管散布于少数细胞中；未见溶酶体（包括初级溶酶体和次级溶酶体）、凋亡小体和自噬小体；脂滴、结晶体等成分也未能观察到。
 

   扫描电镜标本的准备：取体外培养的 GSCP球，经 CD13磁珠（miltenyibiotec）分选后，滴在预先用多聚赖氨酸处理过的玻片上，继续培养2h，用 PBS洗涤一次，用4℃预冷的2.5%戊二醛固定2h，1%锇酸固定2h，按丙酮浓度递增脱水、干燥、粘贴、喷金镀膜后用扫描电子显微镜观察。透射电镜标本的准备：收集约2×10⁶－3×10⁶个体外培养的GSCP，反复吹打成单个细胞后离心，去除上清，加入CD13磁珠4℃孵育30min，让CD13+的细胞可以充分结合磁珠，以便电镜下观察。洗涤两次后，置于2.5%戊二醛溶液（pH7.4）中4℃固定2h或过夜（标本可置于4℃保存，但时间不宜太久）待包埋。包埋前，先要去除戊二醛，用生理盐水洗涤数次后，再置于生理盐水中过夜，次日用1%的锇酸（pH7.4）固定1-2h后先用生理盐水洗除锇酸，然后用由低浓度到高浓度的丙酮或乙醇脱水。脱水后用环氧树脂包埋。待树脂完全聚合、变硬后，对标本块进行修理，并制作超薄切片。最后经重金属盐（枸橼酸铅、醋酸铀等）染色后在电子显微镜下观察。