《食品微生物检测方法确认技术规范》（一）

CNASCL一01：2006《检测和校准实验室能力认可准则》的5．4．5条中对检测方法的确认给出了明确定义：“确认是通过检查并提供客观证据，以证实某一特定预期用途的特定要求得到满足。”CNAS CL 09：2013《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》的5．4条中也明确规定了“标准方法在引入检测之前，实验室应证实能够正确地运用这些方法。在进行方法证实时，样品的选择最好采用自然污染样品或人为添加目标微生物的样品进行方法证实试验。”因此，实验室在使用一种食品微生物检测方法，包括已经发布的标准方法、实验室制定的非标准方法和仪器试剂厂商给出的基于自身产品的检测方法，都要对检测方法涉及的各项要素进行严格认真的验证和确认，确保实验室现有的条件和验证结果数据已经完全满足检测方法和相关规定的要求后方可使用。

目前国内市面上的食品微生物快速检测试剂盒和快速检测仪器种类繁多，其中有相当一部分已经发布了相关的标准．然而还有一大部分快速检测试剂盒和快速检测仪器仍停留在厂商或实验室自行制定的非标准方法阶段。如何在众多的快速检测方法中选择适合实验室自身的检测方法并进行科学的评估，在缩短检测周期、提高检测效率的同时确保检测结果的准确性是广大实验室所面临的问题。国际上一些知名的组织和机构针对食品微生物检测方法的确认制定了相应的确认技术规范，主要有国际标准化组织(Is())发布的ISO16140：2003《食品和动物饲料微生物学——可替代方法的确认规范》(Microbiology of food and animal feeding stuffs--Protocol for the validation of alternative methods)、AOAC发布的《食品和环境表面微生物检测方法确认指南(2011)》、加拿大健康署发布的《食品微生物方法开发和管理程序》等。我国也发布了出入境检验检疫行业标准SN／T 3266—2012《食品微生物检测方法确认技术规范》．这是我国目前唯一的用于食品微生物检测方法确认的权威标准。本节将对SN／T 3266--2012、ISO 16140：2003、AOAC《食品和环境表面微生物检测方法确认指南(2011)》的主要内容进行简要介绍，如有需要，实验室可收集以上这些技术规范和标准的正式文本作为参考，对准备使用的食品微生物检测方法或标准进行确认。

一、SN／T3266--2012《食品微生物检测方法确认技术规范》

我国发布现行的出入境检验检疫行业标准SN／T 3266--2012《食品微生物检测方法确认技术规范》是参考AOAC的《食品和环境表面微生物检测方法确认指南(2011)》和ISO16140：2003，并结合我国当前微生物检测的总体情况进行制定的，该标准对食品微生物定性和定量检测方法中的术语、确认实验的条件和步骤、数据统计方法等内容进行了详细规定，保证通过确认的检测方法准确可靠。

l、术语和定义

(1)待确认方法scope of method validation

拟制订或修订的用于检验给定食品种类中目标微生物的分析方法。

(2)基准方法reference method

国际、国家或行业或组织认可并被广泛接受的方法。优先考虑国际标准化组织(ISO)、中国国家标准(GB)、国际分析家协会(AOAC)推荐的方法，其他国际认可的方法也可以作为基准方法。

(3)方法确认validation of method

使用批准生效的确认方案中所规定的统计学方法，比较分析使用待确认方法和基准方法获得的检测结果，证实待确认方法有足够的可信度。

(4)实验室内确认validated in the laboratory

在组织实验室或方法确认负责人的指导下，在方法制定或使用的实验室内对待确认方法和基准方法进行比较。

(5)部分回收fractional recovery

一组相同接种水平的样品获得阳性结果的数量和阴性结果的数量，阳性结果比例应该大约占总样品数的50％，则满足确认标准。

(6)实验室间协同试验‘Inter-一laboratory collaborative study

在组织实验室和方法确认主持人的控制下，由几个实验室用同样的样品对待确认方法进行试验。

2．方法的确认程序

方法确认应首先根据要求制定方法确认的技术方案，按照技术方案先进行实验室内确认研究试验，然后，由协作实验室用相同的样品进行实验室间协同试验。可采用对待确认方法与基准方法进行比较研究的方式，对方法的性能指标进行确认，具体性能指标如下：

(1)待确认方法与基准方法比较时，定性方法应达到以下性能指标：

——灵敏度98％；

——特异性≥90．4％；

——假阴性率<2％；

——假阳性率<9．6％；

——相对准确度≥94％；

——检测限≤3 CFU／25g或mL～5 CFU／25g或mL。

(2)待确认方法与基准方法比较时，定量方法应达到以下性能指标：

——线性：截距=O，斜率=1(95％的置信区间)；

——选择性：包容性≥98％(30个目标菌株)，排他性≤10％(20个竞争菌株)。

待确认方法与基准方法比较时，需提供二者的重复性值(r)、重复性标准偏差(Sr)、重复性相对标准偏差(RSD_r)、再现性值(R)、再现性标准偏差(S_r)、再现性相对标准皇差(RSD_R)，且在一般情况下，二者没有显著差别。

3．实验室内确认试验

实验室内确认一般在组织实验室内进行，目的是通过使用各种不同种类和类型的食品来证实待确认方法的适用性。微生物方法的适用性说明一般包括目标菌和所涵盖的食品种类。

4．基准方法的选择

用于实验室内确认的基准方法优先采用国际标准化组织(ISO)、中国国家标准(GB)、国际分析家协会(AOAC)推荐的方法，其他国际认可的方法也可以作为基准方法[例如：美国食品药品管理局(FDA)的FDA／BAM等]。