微生物菌种保藏技术

一、任务目标

    掌握石蜡油封藏法和低温斜面保藏技术；理解沙土管保藏法；了解冷冻真空干燥保藏法，液氮超低温保藏法和宿主保藏法；理解菌种衰退的原因和放置衰退的方法；理解菌种复壮的方法。

二、任务相关知识

    菌种是一种资源，无论是从自然界直接分离的野生型菌株，还是经过人工方法选育出来的优良变异菌种，或者基因工程菌株都是非常重要的生物资源。选育一株理想的菌株是一件艰苦的工作，所以菌种保藏非常重要。菌种保藏就是尽可能保持优良菌种的原有性状和活力的稳定性．确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。

(一)菌种的保藏

    在基础研究中，菌种保藏可以保证研究结果获得良好的重复性。对于实际应用的生产菌种．可靠的保藏措施可以保证优良菌种长期高产稳产。菌种保藏的核心问题是降低菌种的变异率，以长期保持菌种的优良特性。鉴于菌种的变异主要发生于微生物生长繁殖的旺盛期，因此必须创造一种环境，使微生物处于新陈代谢水平低．生长繁殖不活跃的状态。

    目前菌种保藏的方法都是根据以下原则设计的：

    ①必须选用典型优良纯种，最好采用它们的休眠体(如芽孢、分生孢子等)进行保藏。

    ②创造一个有利于微生物长期休眠的环境，如低温、干燥(五氧化二磷、无水氯化钙和硅胶是良好的干燥剂)、缺氧、避光、缺乏营养、添加保护剂等。

    ③尽量减少传代次数。

(二)菌种保藏的原理

    低温是菌种保藏中的另一重要条件。微生物生长的温度下限约在一30℃，可是在水溶液中能进行酶促反应的温度下限则在— 140℃左右。这可能就是即使把微生物保藏在较低的温度下，但只要有水分存在，还是难以较长期地保藏它们的一个主要原因。因此，低温必须与干燥结合，才具有良好的保藏效果。在低温保藏中，细胞体积较大者一般要比较小者对低温敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。其原因是低温会使细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞结构尤其是细胞膜的损伤。如果放到低温一70℃下进行冷冻时，适当采用速冻的方法，可使产生的冰晶小而减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故此时快速升温也可减少对细胞的损伤。不同微生物的最适冷冻速度和升温速度是不同的。例如，酵母菌的冷冻速度以10℃／min为宜，而红细胞则相应地为20℃／min。另外，在适宜的介质中冷冻，可以减少对细胞的损伤。例如，5mol／L左右的甘油或二甲基亚砜可透人细胞，并通过强烈的脱水作用保护细胞；大分子物质如糊精、血清白蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)虽不能透人细胞，但可通过与细胞表面结合的方式防止细胞膜受冻伤。在实践中，发现用极低的温度进行保藏时效果更为理想，如液氮温度(一196℃)比干冰温度(一70℃)下保藏效果好，一70℃又比一20℃好，而一20℃比4℃好。

(三)菌种保藏的方法

    由于遗传特性不同，不同的微生物采用的保藏方法也不同。好的保藏方法既能保持原菌种的优良性状长期不改变，还能考虑到方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。下面介绍几种常用的菌种保藏方法：

1.斜面低温保藏法

    将菌种接种在斜面培养基上，在适宜的温度下培养。细菌培养1～2d，酵母菌培养3d，放线菌和霉菌培养5d。再将斜面管置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。菌种斜面保藏的温度及时间要求见表3．11。试管的棉塞最好用橡皮塞替换，再用石蜡封口，可以防止水分蒸发，还能隔绝氧气。此法由于采用4℃低温保藏，大大减缓了微生物的代谢繁殖速度，降低了突变频率。

    此法是试验室和工厂菌种室常用的保藏方法，广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确认培养基特征和纯度无误后再继续保藏。保藏菌种的培养基应无糖，其他菌类含糖以小于2％为宜，以免产酸过多，影响菌种存活。铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。

    优点是操作简单，使用方便，不需要特殊设备，能随时检查所保藏的菌种是否死亡、变异与污染杂菌等，简便易行，容易推广。

    缺点是因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，所以微生物的代谢会改变，菌株容易变异，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和容易被杂菌污染。

    此外．还有半固体保藏法，是用穿刺接种法将菌种接种在半固体培养基中央部分，在适宜温度下培养，然后将培养好的菌种置于4℃冰箱中保藏。此法一般用于保藏兼性厌氧细菌或酵母菌。

2．石蜡油封藏法

    此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面(或半固体穿刺培养物)上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。液体石蜡起阻隔空气(营造缺氧环境)和防止水分挥发的作用，可使保藏期达1～2年，或更长。

    此法适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等。对于霉菌、放线菌和芽孢细菌可以保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1～2年，无芽孢细菌也可保藏1年左右。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。需要注意的是：保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥，需重新移种；液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体．使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜面lcm为宜。

    优点是：简单，效果好，不需要特殊设备，不需要经常移种。缺点是：保存时必须直立放置，携带不方便。另外，从液体石蜡下面取培养物接种后，接种环在火焰上灼烧时，残留的液体石蜡和培养物会一起飞溅，解决方法是将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95％酒精中片刻，再灼烧灭菌，避免液体石蜡四溅，引起污染。