热原检查标准操作规程

一、简述

本规程适用于《中国药典》2010年版热原检查法。

二、实验材料及用具

(1)天平：精度0．01mg或0．1mg，供试品称量用；精度0．1mg或1mg，供试剂称量用；精度10g，供家免称重用。

(2)电热干燥箱，250℃以上，受热均匀。

(3)恒温水浴。

(4)热原测温仪或肛门体温计，精度O．1℃。

(5)家兔固定盒，盒两侧有通气孔。

(6)实验用具：注射器、烧杯、三角瓶、大称量瓶、吸管、移液管、表面皿、玻璃棒、广口试剂瓶、直镊、金属制密封器(均需除热原)、时钟、脱脂棉或细软卫生纸。

(7)试剂：75％酒精、凡士林或50％甘油、生理盐水、灭菌注射用水(经细菌内毒索检查，含细菌内毒素低于O．25EU／mL)、无热原氯化钠(经25O℃30min或200℃1h或180℃2h加热除热原)。

三、供试品溶液的制备

(1)原料药

①精密称定适量，置烧杯、三角瓶或称量瓶中。

②按规定浓度，加精密量取的一定量灭菌注射用水或无热原生理盐水，搅拌使溶解。

(2)注射液

①用75％酒精棉球消毒安瓿颈部，割开安瓿。

②精密量取一定量药液。

③按规定浓度，加精密量取的一定量灭菌注射用水或无热原生理盐水，混匀。

(3)粉针剂

①用75％酒精棉球消毒安瓿颈部或小瓶瓶塞。

②加入一定量规定的溶剂配成所需浓度。

四、实验动物

(1)健康无伤、体重1．7kg以上至4．0kg左右(生物制品检测用家免体重1．7～3．Okg)、同一来源、同一品系、合格的实验家兔，雌兔应无孕，1兔l笼，标兔号。

(2)新兔预选

①新兔经同一饲料饲养7d后，进行预测体温，测温的条件与热原检查要求相同。

②测量体温时，测温仪探头或肛门温度计插入肛门的深度各兔应相同，约6cm，测温时间不得少于1．5min。

③每隔30min测温1次，共8次。

④8次体温均在38．0～39．6℃(一般多选用38．4～39．4℃)的范匍内，且最高最低体温差数不超过O．4℃的家兔，可供3周内实验用。

⑤录选新兔编号、登记人兔史记录卡。未被录选家免．可饲养7d再预测体温1次，如仍不符合要求则淘汰。兔史记录卡内容包括日期、体重、性别、供试品名、正常体温、温差、结果。

(3)家兔的重复使用

①供试品判定为符合规定的家兔，至少应休息48h，方可供下一次实验用。

②供试品判定为需复试的家兔，应暂作休息处理，如复试合格，升温O．6℃的家兔，应休息2周以上，重新测温挑选后使用。

③供试品判定为不符合规定的家兔，不再使用。

④对血液制品、抗毒素和其他同一过敏原的供试品在jd内可重复使用1次。

(4)复试用家兔挑选体重相近、体温相对稳定、正常体温温差小(平均值在38．8～39．2℃)、使用次数少的家兔进行实验。使用过抗原性药品的家兔应避免使用。

五、实验前的准备

(1)测温仪或肛门温度计每3～6个月校验一次，如有异常随时校验，不符合要求者不能使用。

(2)清洗干净的玻璃器皿、注射器、针头、直镊等放人金属制容器内，密闭，置电热干燥箱中经250℃30min以上或200℃lh或180℃2h以上加热除热原。控温时间应从达到规定温度时开始计时。去除热原未曾开启的密封容器内用具，可供一周内使用。

(3)实验室和饲养室的温度控制。

①实验室和饲养室的温度应在17～25℃范围内。

②实验室与饲养室的温度相差不得大于3℃。

③实验全过程中．室温变化不得大于3℃，空调风口不应直对实验动物。

④实验全过程中，室温变化应有记录．与测温时间同步，至少应记录Oh、lh、2h、3h的室温值。

六、检查法

(1)选符台规定的家兔，停止给饲料，称重后置于家兔固定盒内至少1h，头部固定应宽松适宜，以适用于体重不同的动物。

(2)每隔30min测量家兔体温1次，一般测量2次，两次体温之差不得超过O．2℃，不做修约,以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。平均值计算后修约保留三位有效数字，如38．90、39．O，平均为38．95，修约至39．0(如按《英国药典》检查．可保留四位有
效数字如38．95)。

(3)当日使用的家兔，正常体温应在38．O～39．6℃范围内，且同组各兔问相差不得超过1℃。

(4)每个供试样品用家兔3只，在测定正常体温后15min内给药。

①供试品的剂量，应按各该品项下的规定注射，需缓慢注射的药液。注射速度(除另有规定外)一般为每兔4～5min，每分钟4～8mL。

②供试品注射的体积，按家兔体重每千克不小于0．5mL，不大于10mL。供试品溶液温热至约38℃后注射，必要时可用无热原氯化钠调节渗透压。

③供试品制备完毕后应在30mm内注射于家兔体内(个别品种因给药体积过大，可能超过30min)。

④注射前先用75％酒精棉球轻擦耳静脉的注射部位．从耳缘静脉耳尖端进针，如进针不利，应顺序向前进行。

⑤注射完毕，拔出针头时，按住针孔下端数秒钟，止血。

(5)给药后每隔30min测量体温1次，共6次。体温值可保留三位有效数字。

(6)温差计算。

①注射药液后，以6次测得体温中最高的一次减去正常体温，为该兔体温的升温值，计算3只家兔体温升高总和。如6次体温均低于正常体温，则升温值以“O”计。

②6次体温中最低的一次，减去正常体温，即为降温值。

七、结果判定

(1)判断复试

①初试3只家兔中仅有1只体温升高O．6℃或高于O．6℃，或3只家兔升温均低于0．6℃但升温的总数达1．3℃或高于1．3℃(生物制品规定1 4℃或1．4℃以上)．应另取5只家兔复试。

②3只家兔升温值均为0。其中有1只降温值为0．6℃，或3只家兔中有2只降温值在O．5℃．为防止降温影响热原检查，可考虑在消除降温的影响因素后(如动物体温波动异常、室温变化、注射速度、测温异常等)另取3只家兔重试一次后，按《中国药典》规定判断结果。

(2)判断合格

①初试3只家兔中，体温升高均低于O．6℃，并且3只家兔升温的总和低于1．3℃(生物制品为1．4℃)可判断为符合规定。

②复试5只家兔中，体温升高0．6℃或高于O.6℃的家兔数不超过1只,并且初复试合并，8只家兔的体温升高总和为3．5℃或低于3．5℃，可判断为符合规定。

(3)判断不合格

①初试3只家兔中，体温升高O．6℃或高于O．6℃的家兔数有2只或3只，可判断为不符合规定。

②复试的5只家兔中，体温升高0．6℃或高于O．6℃的家兔有2只或多于2只，可判断为不符合规定。

③初复试合并8只家兔的升温总数超过3．5℃，可判断为不符合规定。

八、灵敏度测试和适用性研究

(1)实验用兔灵敏度测试每年应不定期随机抽取体重和使用次数不同的实验用兔按热原检查法要求注射5EU／kg或10EU／kg内毒索标准品，应得到不符合规定的结果。

(2)热原检查适用性研究对未规定热原检查限值剂量的药品，可根据该药品的药理性质，在不影响家兔正常生理的前提下，按体重计算(人按60kg计)，为人用每千克体重每小时最大供试品剂量的2～5倍(化学药品一般为2～3倍，中药为3～5倍)。在为新品种建立热原检测标准时，建议进行适用性实验，即设限值剂量的供试品组、lOEU／kg内毒素组与含10EU／kg内毒素的供试品组，三组同时进行热原检查实验，前者应无异常反应并符合规定，后两者应判断为不符合规定。

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