化妆品微生物学检验操作规程（二）

粪大肠菌群

(1)简述

粪大肠菌群是一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌，在(44．5±O．5)℃培养24～48h能发酵乳糖产酸并产气。该菌直接来自粪便，是重要的卫生指示菌。

(2)仪器a．恒温水浴箱或隔水式恒温箱：(44±O．5)℃；b．温度计；c.显微镜；d．载玻片；e．接种环；f．电磁炉；g．三角瓶25OmL；h．试管：1 5mm×150mm；i．小导管；j．pH计或pH试纸；k．高压灭菌器；I．灭菌刻度吸管：lOmL，lmL；m．灭菌平皿：直
径9cm。

(3)培养基和试剂a．双倍乳糖胆盐(含中和剂)培养基；b．伊红美蓝琼脂；c．蛋白胨水：d，靛机制试剂；e．革兰氏染色液。

(4)操作步骤

①取lOmL 1：10稀释的检液，加到lOmL双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置(44±0．5)℃培养箱中培养24～48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。

②如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置(36±1)℃培养18～24h。同时取该培养液l～2滴接种到蛋白胨水中，置(44±O．5)℃培养(24±2)h。

经培养后．在上述平板上观察有无典型菌落生长。粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润．常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落．亦常为粪大肠菌群，应注意挑选。

③挑取上述可疑菌落．涂片做革兰氏染色镜检。

④在蛋白胨水培养液中．加入靛基质试剂约O．5mL。观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。

(5)结果与报告根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。


铜绿假单胞菌

(1)简述铜绿假单孢菌属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐．在(42±1)℃条件下能生长。

(2)仪器a．培养箱：(42±1)℃、(36±1)℃；b．三角瓶：250mL；c．试管：15mm×150mm；d．灭菌平皿：直径9cm；e．灭菌刻度吸管：lOmL，lmL；f，显微镜；g．载玻片；h．接种环；i．电磁炉；j．高压灭菌器。

(3)培养基和试剂 a．SCDLP液体培养基；b．乙酰胺培养基；c．十六烷基三甲基溴化铵培养基；d．绿脓菌素测定用培养基；e．明胶培养基；f．硝酸盐蛋白胨水培养基；g．普通琼脂斜面培养基。

(4)操作步骤

①增菌培养取1：10样品稀释液10mL加到90mL SCDLP液体培养基中，置(36±1)℃培养18～24h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面多有一层簿菌膜。培养液常呈黄绿色或蓝绿色。

②分离培养从培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种在十六烷基三甲基溴化铵琼脂平板上，置(36士1)℃培养18～24h。凡绿脓杆菌在此培养基上．其菌落扁平无定形，向周边扩散或略有蔓延．表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周嗣培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠艾希氏菌不能生长．革兰氏阳性菌生长较差。

③染色镜检挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。

④氧化酶试验取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1％二甲基对苯二胺试液．在15～30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性；若培养物不变色，为氧化酶试
验阴性。

⑤绿脓菌素试验取可疑菌落2～3个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置(36±1)℃培养24h，加入氯仿3～13mL，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1mol／L的盐酸1mL左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。

⑥硝酸盐还原产气试验挑取可疑的绿脓杆菌纯培养物，接种在硝酸盐蛋白胨水培养基中．置(36±1)℃培养24h，观察结果。凡在硝酸盐蛋白胨水培养基内的小倒管中有气体者。即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。

⑦明胶液化试验 取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内．置(36±1)℃培养24h，取出放冰箱10～30min，如仍呈溶解状时即为明胶液化试验阳性；如凝固不溶者为阴性。

⑧42℃生长试验挑取可疑的绿脓杆菌纯培养物．接种在普通琼脂斜面培养基上，放在(42±1)℃培养箱中，培养24～48h，绿脓杆菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。

(5)结果与报告被检样品经增菌分离培养后，在分离平板上有典型或可疑菌落生长，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出绿脓杆菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出绿脓杆菌。

金黄色葡萄球菌

(1)简述金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽孢，无荚膜．能分解甘露醇．血浆凝固酶试验阳性。

(2)仪器a．显微镜；b．培养箱(36±1)℃；c．离心机；d．灭菌刻度吸管：10mL，1mL；e．试管：15mm×15Omm；f．载玻片；g．酒精灯。

(3)培养基和试剂 a．SCDLP液体培养基；b．Baird Parker平板；c．7．5％氯化钠肉汤；d．血琼脂培养基；e．甘露醇发酵培养基：f．兔(人)血浆制备。

(4)操作步骤

①增菌取l：10稀释的样品10mL接种到90mL SCDLP液体培养基中，置(36±1)℃培养箱，培养(24±2)h。

②分离 自上述增菌培养液中，取l～2接种环，划线接种在Btfird Parker平板，如无此培养基也可划线接种到血琼脂平板，置(36±1)℃培养24～48h。在血琼脂平板上菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑．周围有溶血囤。在Balrd Parker平板上为圆形，光滑，凸起，湿润，直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色。周围为一浑浊带，在其外层有一透明带。用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落．但无浑浊带及透明带。挑取单个菌落分铺在血琼脂平板上，置(36±1)℃培养(24±2)h。

③染色镜检挑取分纯菌落．涂片，进行革兰氏染色，镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，排列呈葡萄状，无芽孢，无荚膜，致病性葡萄球菌．菌体较小，直径为O．5～1μL。

④甘露醇发酵试验取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中，在培养基液面上加入2～3mm的灭菌液体石蜡．置(36±1)℃培养(24±2)h，金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。

⑤血浆凝固酶试验吸取1：4新鲜血浆0．5mL，放入灭菌小试管中，加人待检菌(24±2)h肉汤培养物O．5mL。混匀，放(36±1)℃恒温箱或恒温水浴中，每半小时观察一次,6h之内如呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0．5mL，分别加入灭菌l：4血浆O．5mL，混匀，作为对照。

(5)结果与报告凡在选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者．可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。

霉菌和酵母菌

(1)简述霉菌和酵母菌数测定是指化妆品检样在一定条件下培养后，lg或1mL化妆品中所污染的活的霉菌和酵母菌数量。借以判明化妆品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般卫生状况。

(2)仪器和设备a．培养箱：(28±2)℃；b．振荡器；c．天平；d．三角瓶25OmL；e试管：15mm×150mm；f．灭菌平皿：直径9cm；g．灭菌刻度吸管：10mL，1mL；h．量筒200mL；i．酒精灯；j．高压灭菌器。

(3)培养基和试剂 a．生理盐水；b．虎红(孟加拉红)培养基。

(4)操作步骤

取l：lO、1：100、1：1000的检液各lmL分别注入灭菌平皿内．每个稀释度各用2个平皿，每皿分别注入熔化并冷至(45±1)℃左右的虎红培养基。充分摇匀。凝同后，翻转平板，置(28±1)℃培养(72±2)h，计数平板内生长的霉菌和酵母菌数。若有霉菌蔓延生长，为避免影响其他霉菌和酵母菌的计数时．于(48±2)h应及时将此平板取出计数。

(5)菌落计数 点数每个平板上生长的霉菌和酵母菌苗落数，求出每个稀释度的平均菌落数。

酵母菌在培养基表面生长多为圆形。内层生长者为圆形、铁饼形、纺锤形或三角形，多数直径为1～2mm，在同一平板上生长的菌落大小有时不一致，呈乳白色或粉红色多见，透明度较差，边缘整齐，表面光滑湿润，少数呈毛状、三角状．偶有呈干皱形。与培养基不结合，易挑起。镜检中．酵母菌个体较大，常有芽体相连。

霉菌在培养基上多数菌落为圆形，有的蔓延生长为无定形．可能为稀疏絮状、绒状、絮状、丝绒状，也有无菌丝的，部分菌落贴于基质呈细菌菌落状。小菌落灰白，大菌落形成孢子后颜色多样，有灰白色、灰褐色、蓝紫色、绿色、褐色、粉红色、黄色、白色等，菌落正反面颜色不同。菌落边缘由茵丝体构成．为放射状。菌落与培养基结合较牢同，不易挑起，镜检中，菌丝体相互交织．成熟霉菌常有产孢组织及孢子。

(6)结果与报告应选取菌落数在5～50个范围之内的平皿计数，乘以稀释倍数后，即为每克(或每毫升)检样中所含的霉菌和酵母菌数。其他范围内的菌落数报告应参照化妆品中菌落总数测定的报告方法报告。每克(或每毫升)化妆品含霉菌和酵母菌数以CFU/g(mL)表示。