化妆品微生物学检验操作规程（一）

一、总则

(1)简述本规程用于化妆品微生物学检验的基本要求，用于化妆品样品的采集、保存及供检样品制备。

(2)仪器和设备a．天平；b.高压灭菌器；c．振荡器；d．三角瓶250rmL；e．玻璃珠；f．玻璃棒；g．刻度吸管：1mL，10mL；h．研钵或均质器；i．恒温水浴锅。

(3)培养基和试剂 a．生理盐水；b．SCDLP液体培养基；c.灭菌液体石蜡；d．灭菌吐温-80。

(4)样品的采集及注意事项

①所采集的样品，应具有代表性．一般视每批化妆品数量大小．随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mL。包装量小于20g的样品，采样量应适量增加样品的包装数量。

②供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂．在检验之前不得打开，防止样品被污染。

③接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验．样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。

④若只有一份样品而同时需做多种分析时．如细菌、毒理、化学等，应先取出样品做细菌检验，再将剩余样品做其他分析。

⑤在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散,所用器皿及材料均应事先灭菌．全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下．按无菌操作规定进行。

⑥如检出粪大肠菌群或其他致病菌，自报告发出之日起该菌落及被检样品应保存一个月。

(5)供检样品的制备

①液体样品

a．水溶性的液体样品量取．10mL加到90mL灭菌生理盐水中，混匀后，制成l：10检液。如样品少于10mL，仍按10倍稀释法进行；如为5mL则加到45mL灭菌生理盐水中，混匀后，制成1：10检液。

b．油性液体样品 取样品10mL，先加5mL灭菌液体石蜡，混匀．再加10mL灭菌的吐温-80，在如～44℃水浴中振荡混合10Min，加入灭菌的生理盐水75mL(在40～44℃水浴中预温)，在40～44℃水浴中乳化，制成1：10的悬液。

②膏、霜、乳剂半固体状样品

a．亲水性的样品 称取10g，加到装有玻璃珠及90mL灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，静置15min。取其上清液作为l：10的检液。

b．疏水性样品 称取lOg，放到灭菌的研钵中，加10mL灭菌液体石蜡，研磨成黏稠状，再加入lOmL灭菌吐温-80，研磨待溶解后，加70mL灭菌生理盐水，在40～44℃水浴中充分混合，制成1：10检液。

③固体样品 称取lOg，加到90mL灭菌生理盐水中．充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为l：10的检液。

如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等．可称lOg样品加入90mL灭菌生理盐水，均质1～2min；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称lOg样品，加。l0mL灭菌液体石蜡，10mL灭菌吐温-80，70mL灭菌生理盐水．均质3～5min。

二、菌落总数

(1)简述菌落总数是指化妆品检样经过处理，再一定条件下培养后(如培养基成分，培养温度，培养时间，pH值，需氧性质等)，lg(1mL)检样中所含菌落的总数。

(2)仪器和设备a 三角瓶250mL；b．量筒200mL；c．pH计或精密pH试纸；d．高压灭菌器；e．试管：15mm×150mm；f．灭菌平皿：直径9cm；g．灭菌刻度吸管：10mL，1mL；h．酒精灯；i．恒温培养箱：(36±1)℃；j．放大镜。

(3)培养基和试剂 a．生理盐水；b．卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基；c．0.5％氯化三苯四氮唑。

(4)操作步骤

①用灭菌吸管吸取l：10稀释的检液2mL，分别注人两个灭菌平皿内，每皿lmL。另取lmL注入9mL灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面)，更换一支吸管，并充分混匀，制成1：100检液。吸取2mL。分别注入两个灭菌平皿内．每皿lmL。如样品含菌量高．还可再稀释成1：1000、1：10000等，每种稀释度应换1支吸管。

②将熔化并冷至45～50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置(36±1)℃培养箱内培养(48±2)h。另取一个不加样品的灭菌空平皿．加入约15mL卵磷脂吐温-80
营养琼脂培养基，待琼脂凝固后．翻转平皿，置(36±1)℃培养箱内培养(484±2)h，为空白对照。

③为便于区别化妆品中的颗粒与菌落．可在每100mL卵磷脂吐温80营养琼脂中加入1mL 0．5％的TTC溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。

(5)菌落计数方法 先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5～10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后．求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时．该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。

(6)结果与报告

①首先选取平均菌落数在30～300个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时．即以该平皿菌落数乘其稀释倍数(见表9-5中例1)。

②若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2．应报告其平均数，若大干2则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数(见表9—5中倒2及例3)。

③若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表9-5中例4)。

④若所有稀释度的平均菌落数均小于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表9 —5中例)。

⑤若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30个或300个的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表9-5中例6)。

⑥若所有的稀释度均无菌生长。报告数为每克或每毫升小于10CFU。

⑦菌落计数的报告．菌落数在10个以内时，按实有数值报告之，大于100个时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，应以四舍五人法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用lO的指数来表示(见表9-5报告方式栏)。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。