以双链DNA为模板的定点突变

  由于M13噬菌体的遗传操作对于许多研究者来说还是不太方便，因此，又陆续开发了许多基于质粒的定点突变方法，其中最方便的应属一种基于双链DNA的、寡核苷酸介导并用Dpn I选择突变体的定点突变技术。这种定点突变技术的主要操作过程如图6．15所示。这种方法中突变也是通过寡核苷酸引物带入的，但此时要求两条带突变点的引物。

该方法的主要特点之一是用限制酶D加I选择突变体。Dpn I能特异性消化完全甲基化的序列G^me6ATC。由于从大肠杆菌中分离得到的质粒和噬菌体已经在细胞内的Dam甲基化酶作用下被完全甲基化了，因此对DpnT敏感；反之，在体外使用高保真性Pfu聚合酶通过PCR扩增合成的DNA没有甲基化，可以完全抵抗Dpn I的切割。用Dpn I酶切PCR产物把模板去除，将剩余的突变的线形化PCR产物纯化和连接后，用重新连接的质粒转化大肠杆菌，使携带所期望突变的转化子菌落在选择性培养基上生长。

另外，为了保证引物延伸合成互补链的准确性，该方法需要采用有校对活性的聚合酶，如Pfu、Pwo等。

1.利用简并寡核苷酸引物进行定点位置上的随机诱变

在很多情况下，研究人员可能并不能确切地知道在基因中引入怎样的突变可以达到研究的目的。因此，可能需要在某一点引入一系列的突变，将原来的某个氨基酸改变成数种甚至是各种可能的氨基酸，然后再从突变产物中筛选出符合特定要求的蛋白质。这时，就需要采用简并引物进行基因的特定位置上的随机诱变。这种简并引物制备方法是，在化学合成DNA片段时，在特定的位置以一定比例的四种脱氧核苷酸代替原来应该加入的某一种单一脱氧核苷酸。这样，得到的引物在特定位置具有包含了一系列随机突变。

很多定点突变方法都可以采用简并寡核苷酸作为引物进行DNA特定位置上的随机突变。这种DNA特定位置上的随机突变有两个优点：一是不需要特定氨基酸在蛋白质功能中所起作用的详细信息；二是可以在特定位置上产生多种氨基酸的变化，从中可能筛选到一些意想不到的具有特殊性质的蛋白质。

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