初代细胞培养法

  初代细胞的培养也叫原代培养，是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。初代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很才变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性。初代细胞往往有多种细胞组成．比较混杂，即使从形态上为同一类型(上皮样或成纤维样)，但细胞间仍有很大差异。

一、初代细胞培养

(一)贴壁细胞初代培养(也适于半贴壁细胞培养)

凡经消化处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗．以尽量除去消化液的毒性，细胞捶种时浓度要稍大一些，至少为5×10⁸个／L，在起始的2d中尽量减少振荡，以防止刚贴壁削细胞发生脱落。若初代贴壁细胞不是用于长期培养，只是用于分离繁殖或测定病毒之用，其细胞浓度可以加大，尽量贴成厚层。待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，此时的pH若苇明显变化，应将初代细胞换液，换人新鲜的培养基，以便除去衰老、死亡的细胞和陈旧的耀养基，使贴壁细胞能获得充足的营养。

1．材料

(1)标本：各类实体组织材料。

(2)试剂：消化液、PBS、Hanb液、培养液。

(3)器具：手术刀、眼科剪、不锈钢(尼龙)的筛网；平皿、三角烧瓶、培养瓶、吸管、离心管、血细胞计数板。

2．操作步骤(图3-1)

(1)准备：取各种已经消毒的培养用品置于净化台内，紫外消毒20min。组织块、培养液等易受紫外线损伤的物品在进行培养时再放人操作野中。

(2)漂洗、剪切、消化组织：将组织块在平皿中用无钙、镁PBS洗2～3次。组织块剪成3～5mm³大小的小块。剪碎的组织块放人三角烧瓶中，加入比组织量多30～50倍能0.25%胰蛋白酶消化液。置于电磁搅拌器台上，或置于37℃水浴锅(37℃温箱中)，每隔5～10min轻摇1次，组织块蓬松呈絮状可终止。亦可采用冷消化法，即加入胰蛋白酶消让藏后．4℃过夜或更长。消化的时问依据组织块的大小和组织的硬度而定。

(3)分离：在消化过程中见消化液浑浊，可用吸管吸取少量消化液在镜下观察，如果组织已经分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化。低速离心(500～1000r／min)离心5min，去上清液，采用Hanks液漂洗法洗2～3min，离心去上清液，共2次。通过适宜的不锈钢筛网，滤去尚未充分消化的组织块，低速离心(500～1000r／min)离心5min，去上清液，加人一定量的培养液。

(4)细胞计数：用细胞计数板计数，如果细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整。分装入培养瓶中。

(5)培养：细胞培养瓶置入37℃培养箱内进行培养。

(二)悬浮细胞的初代培养

凡来自外周血、胸腹水、脾、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞。

1．材料

(1)标本：离心后的血液、羊水、胸腔积液或腹水的悬液材料。

(2)试剂：消化液、PBS、Hanks液、培养液。

(3)器具：手术刀、眼科剪、不锈钢(尼龙)的筛网；平皿、三角烧瓶、培养瓶、吸管、离心管、血细胞计数板。

2．操作步骤

(1)制备细胞悬液，计数并用培养液调整细胞的密度。

(2)在培养器皿中(培养皿、培养瓶、三角烧瓶)加人足量的培养液。

(3)将欲培养的细胞接种到培养皿中。对于生长快、倍增时间短的细胞，接种的细胞量可以少些。相反，对于生长慢、倍增时间长的细胞，接种数量需要多衅。

(4)在培养皿中放入一个有聚四氟乙烯包被的磁棒。将培养皿封口，送人培养箱中。在磁力搅拌器上边搅拌边培养，搅拌的速度大约60～100r／min。如果细胞是接种在培养瓶或试管内，封口后可将培养瓶或试管固定在恒温摇床上．边摇动边培养，无须放置磁棒。有些细胞也可以不用磁棒及磁力搅拌器，也不必使用恒温摇床，接种于预先用硅脂(5％～10％)包被过的培养皿(涂布后用干热消毒)内直接在培养箱中静止即可。

(5)培养液略黄时换液。吸出部分培养液，加入新鲜培养液。

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