细胞冻存、复苏与运输

  一、细胞冻存

细胞冻存是指将细胞悬于细胞冻存保护剂中，以一定的冷冻速度将细胞悬液降至70℃以下，常于一196℃的液氮罐中长期保存。细胞冻存可保持传代细胞的某些性质的相对稳定，同时也减少了长期传代中支原体等微生物污染的机会。

(一)冻存原理

如果向冻存的细胞中加入冷冻保护剂，可使冰点降低，减少细胞内外冰晶的形成，从而降低了细胞在冻存过程中的损伤程度。常用的冷冻保护剂为二甲基亚砜(DMS0)和甘油。

(二)材料

1．待冷冻细胞。

2．试剂消化液、含冷冻保护剂的培养液。

3．器具吸管、离心管、冻存管、细胞计数板。

(三)操作步骤

1．选用指数生长期的细胞，在冻存细胞前ld换液1次。

2．贴壁细胞需用常规方法将细胞消化下来，制备成单细胞悬液。单细胞悬液离心1000r／min离心5min，吸出上清液。

3．向细胞沉淀中加入含冷冻保护剂的培养液(含有10％DMSO)，细胞计数，调整细胞浓度至1～10×10⁶／ml，制成细胞悬液。

4．将细胞悬液分至无菌的冻存管中，扭紧管盖。写明细胞种类，冻存日期。

5．为保持细胞最大存活率，一般采用逐渐降温的方法，标准冻存程序：

(1)当温度在*25℃以上时，下降-2～ -1℃／ml’n。

(2)当温度达*25℃以下时，下降-10～-5℃／min。

(3)当温度达-100℃时，可迅速放人液氮中。

6．实际可按下列顺序降温：室温→4℃(20min)→冰箱冷冻室(20℃．30min)→低温冰箱(一30℃，2h)→低温冰箱(一80℃，过夜)→液氮瓶口气态氮(：30min)→液氮。

注意：液氮定期检查．随时补充，绝对不能挥发干净。一般30立升的液氮能用1～1．5个月。

二、细胞的复苏

细胞复苏指按一定的复温速度将冻存的细胞恢复到常温。

(一)材料

1．待复苏的细胞。

2．试剂培养液。

3．器具离心管、吸管、培养瓶。

(二)操作步骤

1．将水浴锅预热至37℃。

2．根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。从液氮罐中取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

3．迅速将冻存管投入到已经预热37℃的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。约1～2min后冻存管内液体完全溶解，从水浴锅取出。

4．迅速l000r／min离心5min，吸出上清液。向离心管内加入适量培养液，吹打制成细胞悬液。

5．将细胞悬液吸到培养瓶内，补足培养液，将培养瓶放入培养箱内培养。4～6h后，待细胞贴壁后，轻轻倒掉含有冻存液的培养液，换培养液继续培养。

(三)注意事项

1．应该在l～2min内使冻存细胞完全融化，复温速度太慢会造成细胞损伤。

2．复苏过程中应佩戴护目镜和手套。复苏时冻存管内温度急剧上升，可导致爆炸，应予与保护。

三、细胞的运输

在购买细胞时，需要根据保存方式和运输时间，采用适当的运输方法。

(一)充液法保存运输

1．选生长状态良好的细胞，待达80％或90％汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的颈部(过满易污染)，保留少许空间，拧紧瓶盖，然后用胶带将瓶口密封。

2．经妥善包装情况下，一般在不超过4～5d到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响。

3．细胞到达目的地后，倒出大部分细胞培养液，保留正常量，置37℃培养，次日传代。

(二)冰瓶运输

在较短的时间内运输细胞，可将未冷冻的细胞悬液放人装有碎冰的冰瓶内，以保持细胞的活力。

(三)液氮罐运输

细胞冻存后，将有细胞的冻存管放入液氮罐内进行运输。在液氮罐搬运过程中，要防止液氮外漏。

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