新生大鼠骨骼肌细胞培养方法

  (一)原代培养法

1.将新生大鼠用颈椎脱位法处死，去除足趾及尾巴。70％酒精消毒后固定于解剖板上。

2.去除后腿皮肤，用血管钳分离并剪切大腿肌肉。用含抗生素(青霉素100IU／ml、链霉素100μg／ml)的PBS冲洗2次。

3.将肌肉组织放人装有用D—Hanks液配制的0．25％的胰蛋白酶溶液瓶中。瓶中预先放人一个磁棒，37℃(或室温)磁力搅拌器上消化多次，每次10min。

4.利用沉淀法收集上清液中悬浮的细胞，未消化部分可继续用同样方法消化。

5.向细胞悬液中加入终浓度为10%的马血清，终止胰蛋白酶消化作用。2500~3000r／min离心3~5min，用少量的培养液重新悬浮细胞，钢网过滤细胞悬液。

6.计数悬液细胞数。调制细胞浓度为1 X 10⁶／ml。

7.接种细胞时，按60mm培养皿接种2～3×10⁶细胞数为宜。37℃、5%CO₂孵箱培养。

(二)骨骼肌细胞纯化

骨骼肌细胞的贴壁速度比非肌源性细胞慢，为此，可以用差速贴壁法获得较高纯度的肌源性细胞。具体方法是：

1.取原代培养早期的细胞(培养30~40h)，经洗涤后，用0．25%的胰蛋白酶溶液消化。细胞开始脱壁时以马血清终止消化。

2．收集脱壁的细胞，洗涤后用培养液制备成细胞悬液。

3．立即接种到另一培养板上，贴壁40min。此时，多数非肌源性细胞已经贴壁，而骨骼肌细胞仍悬浮在培养液中，或沉降到培养板上但未贴壁。

4．吸出未贴壁细胞，计数后将细胞调至所需细胞浓度，进行接种。

5．接种后，骨骼肌细胞纯度可达到90％以上。该方法亦可用于直接经胰蛋白酶溶液消化的肌肉组织细胞。

(三)骨骼肌细胞的克隆化培养

1．明胶处理培养皿，将明胶覆盖于培养皿一层即可。

2．制备饲养细胞将饲养细胞(可为鼠传代细胞，或其他细胞)经60GyX线照射后，以0．5～l×10⁵个／皿铺于培养皿。

3．将原代或传代培养的骨骼肌细胞计数并进行有限稀释，每培养皿接种25～100个细胞。在适宜的条件下，细胞增殖一代的时间为11～13h。一般在培养3～6d开始形成克隆。在无饲养层细胞时亦可形成克隆，但易受培养条件影响而降低克隆形成率。

4．单一克隆分离及传代，先以蜡笔标记出显微镜下观察到的克隆，吸去培养液，以克隆环套住克隆并以硅脂封闭。向环中加l滴0．25％胰蛋白酶溶液。数分钟后吸出细胞悬液，接种到新的培养板上。从原代培养的细胞获得的克隆通常可传1～2代，但肌源性细胞株则易于进行连续传代，可克隆多次。

三、结果观察

在接种后数小时，多数细胞即可贴附至培养瓶(皿)。培养瓶中主要应为单个核的肌细胞．梭形、折光性较强可与非肌源性细胞相鉴别。接种培养约50h后，可见明显细胞融合，并能形成纤维网。数天后细胞融合停止。融合后ld可见肌纤维的自发性收缩，l～2d后骨骼肌细胞的特征性横纹变得明显。利用放射自显影、细胞化学及生物化学等方法可分析与融合有关的细胞合成活动的变化。

四、冷冻保存

骨骼肌细胞也可以用冷冻保存的方式长期保种。

1．将肌细胞消化后配成约10⁶个／ml的细胞悬液，用含20％马血清，12％DMSO的细胞培养液配制，每个2ml的冻存管中加入lml细胞悬液，做好标记。

2．先将冻存管置于4℃数小时，放于一20℃数小时。放在经4℃预冷的壁厚lcm以上的泡沫塑料盒内，置于80℃低温冰箱中，使冻存管达到缓慢制冷的效果。l～2d后．可将冻存管放人液氮中长期保存。

3．解冻时，将冻存管从液氮罐中取出，立即放人37℃水浴中迅速解冻。台式离心机离心1500 r／min。然后吸去上清液，以新鲜培养液稀释细胞沉淀，接种培养于培养皿或培养瓶中。也可不离心，直接将细胞悬液接种至培养瓶中，加培养液进行培养。细胞贴壁后可按常复方法换液。

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