HLA的抗体分型技术

  (一)基本原理

具高度多态性的HLA糖蛋白大多表达在有核细胞的表面，应用微量淋巴细胞毒技术，将PBMC与已知抗HLA特异性抗体(同种抗血清或单克隆抗体)及兔补体混合培养，已知抗体与带有相应抗原的细胞结合并激活补体，通过计数死亡细胞比例来判断检测结果。

(二)材料

1．待检外周(肝素)抗凝血液、淋巴细胞分离液。

2．专用抗体分型板该板实质是包被有不同抗体的微孔培养板，根据各孔包被的抗体的不同，制成检测不同位点或国际型、亚洲型等不同系列的专用板。

3．分离淋巴细胞的有关试剂，有关颜料(曙红)等，购买抗体板时成套配给。

4．加样器、倒置显微镜。

(三)方法

1．将配型板室温放置15min(补体已加于冷冻板内)。

2．取待检测者肝素抗凝血3～5ml，经淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，每孔加1μl待检淋巴细胞(细胞分离剂法分离)，细胞浓度约为2×10⁶／ml。

3．室温下孵育lh，每孔加5μl曙红，2min后加5μl福尔马林固定。

4．终止反应后15min可读板。

(四)结果分析

根据细胞死亡的百分比判断抗原一抗体反应。曙红染色，在相差倒置显微镜下，活细胞镜下明亮，死细胞呈深暗色。目前．国际上通用NIH方法计分，详见表11-1。每块配型板均附有一份反应记录表，将阳性反应结果读数填到相应孔空格内。每一批号的配型板都附有反应格局判断表，以帮助指定相应的抗原。

1．本底过高即死细胞过多，出现假阳性。常见于细胞分离和所用试剂不当。解决办法：①改善细胞分离方法。最好用免疫磁珠法，普通倒置显微镜可观察T磁珠分离的T缉胞，但B磁珠分离B细胞需荧光显微镜。②分离出的淋巴细胞应溶于5％的McCoy’s液中：

2．细胞量过少或过多解决方法：加细胞前检测细胞含量。

3．反应弱解决办法：①避免应用RPMI(可抑制抗原表达)；②检测试剂pH(偏高可抑制反应)；③加样后用静电混合器或金属丝混匀；④延长孵育时间。

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