常用细胞因子活性的检测技术

  细胞因子(cytokine，CK)是由活化免疫细胞和非免疫细胞(如某些基质细胞)合成分泌的能调节细胞生理功能、参与免疫应答和介导炎症反应等多种生物学效应的小分子多肽或糖蛋白。检测免疫细胞所分泌的细胞因子可反映细胞的功能状态，亦是临床上探索疾病发病机制、判断预后和考核疗效的指标。这些细胞因子的活性和含量可以通过体外培养免疫活细胞或细胞因子依赖株来进行检测。本节主要介绍白介素(IL一1、IL一2、IL一6)、干扰素(IFN)、集落刺激因子(CSF)及肿瘤坏死因子(TNF)的活性检测。

一、白介素一1活性测定

(一)原理

小鼠胸腺细胞在丝裂原刺激下表达白介素(interleukin，IL)受体，在有IL一1同时存在的条件下，IL-1可协同丝裂原促进T细胞的增殖。根据加入IL-1后细胞增殖水平(³ H—TdR掺人率)的变化可计算出样品中IL一1的活性单位，或计算出刺激指数。

(二)材料

1．IL一1待测样品，用10％FCS RPMI 1640培养液倍比稀释。

2．IL一1、刀豆蛋白A(ConA)标准品。

3．6～8周龄C57BL／6小鼠。

4．10％FCS RPMI 1640培养液。

5．³ H—TdR(0．5 μci／50μl)。

6．闪烁液。

7．9999型玻璃纤维滤纸。

8．细胞收集仪。

9．B液闪计数仪。

(三)方法

1．取6～8周龄C57BL／6小鼠，拉颈处死．无菌取胸腺制成细胞悬液，调整细胞浓度为1～1．5×10⁷／ml。

2．细胞悬液内加入ConA，使ConA终浓度为2～3μg／m1．加入至96孔培养板中，每孔 100μl(细胞数为l～1．5×lO。／孔)。

3．加入不同稀释度待测样品和IL一1标准品100μl／孔(CorA终浓度为1～l.5 μg／ml)，一种稀释度设3个复孔，37℃、5％CO₂旺孵箱中培养60 h。

4．每孔加。H—TdR O．5μci，37℃、5％C0₂孵箱中培养6 h。

5．多头细胞收集仪将细胞收获于9999型玻璃纤维纸上。

6．烤干，移人液闪瓶中，加适量闪烁液，于液闪仪上测B计数。

(四)结果分析

对不同稀释度的IL一1标准品作标准曲线，从IL-1标准曲线上测得样品中IL-1的活性单位。

(五)注意事项

1．不同品系小鼠对IL一l的反应性有差异，据国内资料报道以G57BL为好。

2．不同周龄小鼠胸腺细胞对conA反应性不一，一般选用6～8周龄，小于5周或大于10周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应不稳定。

3．ConA作用浓度要进行预试。

来源：中国微生物菌种网www.bnbio.com