培养细胞转化实验

肿瘤对人类健康危害极大，但由于其发生因素复杂，包括体内因素和环境因素，如遗传因素，物理、化学、生物因素等，导致各种肿瘤的发生机制各不相同。至今尚有许多肿瘤的发病机制、准确诊断、有效治疗均不明确，尚需深入研究。肿瘤细胞具有永生性，在体外可以无限传代培养，因此体外细胞培养技术则成为研究肿瘤细胞生物学特性、肿瘤发生机制以及肿瘤药物的筛选等重要手段。本章主要介绍细胞转化试验、肿瘤细胞浸润实验、肿瘤细胞癌基因及抑癌基因检测等方面的相关实验。

细胞恶性转化，即癌变，是一个发生在体内的过程，但在细胞培养条件下，可以用人T方法诱发产生，建立体外癌变模型。因此，人工诱发体外培养细胞的转化，是研究癌变原理的重要方法，其优点不仅是重复性好，可广泛用于研究可疑致癌因素的作用和检测环境中的致癌物，并且在细胞发生转化后，能够进行直接观察和做各种分析。为此，这一技术当前在国内外已普遍应用。转化实验的方法主要包括人工诱导细胞转化、试管内诱发癌实验法和体内分化诱导方法。

一、人工诱发细胞恶性转化

在细胞培养条件下，用化学、物理和生物等各种致癌物可人为地诱发细胞发生恶性转化。条件是要让细胞直接受到致癌物的作用，从细胞受到作用后到发生恶性转化一般需两周到三个月的时间。

(一)原理

细胞转化基本过程包括诱发、损伤与修复、发展和表现3阶段。

1．诱发也称启动，是致癌物或诱变剂诱发损伤的过程。在实验中常用的是致癌化学物，它们分直接致癌物与间接致癌物。直接致癌物能直接损伤DNA诱发癌变；间接致癌物又称前致癌物，需经过某些酶的活化，形成终未致癌物后，才能发生致癌的作用，终未致癌物具有强的亲电子性质，易与细胞核中含电子多的DNA、RNA和蛋白质等相结合，从而导致DNA的损伤，发生转化过程中的启动作用。

2．DNA的损伤与修复DNA损伤后可进行自我修复。修复是一复杂的过程，存在着不同修复机制和产生不同的结果。无误性的修复可使损伤DNA复原，但错误性修复能引起DNA结构发生改变。当DNA损伤后如发生了错误性修复，而这种变化被固定下来即形成不可逆的改变，标志着发生了突变。

3．发展和表现细胞DNA受损和被固定后，通过细胞的反复增殖，使细胞损伤进一步得到发展和表现。受到一定剂量致癌物处理的细胞群，并非所有细胞都一定受到损害。受到诱发并进入转化发展阶段的细胞仅是一小部分，这些细胞称为癌前细胞(precancerouscell)。它们生长在那些未受损的正常细胞之中，随着转化而不断发展，细胞汇合后也不发生接触抑制，仍继续分裂增殖，并由于数量的增多而堆积起来，形成明显可见的转化灶。本实验将用仓鼠胚胎原代细胞进行转化实验。

(二)材料1．试验用细胞仓鼠胚胎，于妊娠后第13d取材。

2．试剂

(1)0．25％胰蛋白酶。

(2)N-甲基-N´-硝基一N一亚硝基胍(N-methyl—N´-nitro—N—nitrosoguanidine；MNNG)。

(3)含20％和5％小牛血清培养液。

(4)PBS。

(三)实验步骤

1．将数个或所有同窝妊娠后13d仓鼠胚胎取出，去头和内脏，在无菌条件下剪碎至米粒大小，再用0．25％胰蛋白酶(含O．01％EDTA)37℃中消化30min，吹打数次后滤过，1000r／min离心5min。去除上清液消化液，加Hanks洗一次，沉淀细胞加入营养液，制备5×10⁵的细胞悬液，接种人培养瓶中，37℃培养2～3d，能迅速长满瓶。

2．选生长状态良好的细胞，冻存，贮以备用(传代过多不利细胞转化)。

3．致癌物处理取冻存细胞解冻接种人25[nl培养瓶中，每瓶含细胞(1～3)×lO⁵待细胞生长进入指数增生期时，向培养瓶中加入致癌剂。致癌剂常用MNNG，剂量为1～3μg／ml营养液，在37℃孵箱中培养12～48h。

注意：MNNG水溶液，有毒，用时注意防止污染环境；避光阴凉处保存，试验用液现配现用。用MNNG处理细胞不宜超过48h。

4．弃掉MbJNG作用液，用温PBS洗l～3次，加人含20％小牛血清培养液继续置孵箱中培养2～3周，(如用人细胞则需1～3个月)，然后更换培养液，用含5％血清培养液培养。低血清培养液不利于正常细胞生长，但已转化的细胞仍可增殖，易形成转化灶。

5．转化灶的形成和分离：在成功情况下，用致癌物处理过的细胞于10d后．在正常细胞之间可产生数量不等的转化灶。转化灶由密集的重叠细胞群组成；灶的大小不等．小者由几十或几百个细胞构成，大者肉眼可见。

6．转化灶细胞分离纯化

可用两种方法：

(1)刮除法：先在有转化灶处瓶壁上用蜡笔圈出记号，再用胶皮刮刮未转化的正常细胞，向瓶内加入PBS冲洗掉刮除细胞后，加O．25％胰蛋白酶少许置37℃温箱中消化5～10min，待细胞松散后．弃掉消化液，加入新鲜含10％～20％小牛血清培养液，以中止残余胰酶消化作用，用吸管反复吹打转化灶，使之脱离瓶壁成细胞悬液，再置37℃温箱。

(2)消化法：先在瓶壁上用蜡笔圈出转化灶，弃掉瓶内培养液，选生长状态良好的转化灶，用小不锈钢环或无毒硅橡胶圈沾少许无菌明胶(不用亦可)套在转化灶上；向圈中滴20％胰蛋白酶充分消化后，用弯头吸管把胰酶与细胞一同吸出接种入新培养瓶中，再补加营养液少许；置孵箱中继续培养。数日后转化细胞迅速增殖成新的细胞群。

(四)结果观察

高倍镜下观察，转化细胞与正常细胞不同，如成纤维型细胞发生转化后，胞体变大成类多角形，生长无方向性，失去接触抑制，向三度空间伸延，细胞相互重叠。在转化灶的边缘转化细胞与正常细胞界限分明，形态区别非常明显。上皮细胞转化后，形态上不如成纤维细胞差别大，需仔细辨认。

(五)转化细胞的鉴定

用诱变剂或致癌物诱发细胞转化，获得转化细胞群后，为确定转化细胞的性状，需进一步做一系列实验分析进行转化细胞的鉴定。

1．细胞生物学一般性状：包括细胞形态、生长速度、倍增时间等。

2．细胞遗传学特征：核型分析，染色体组型畸变和标志染色体的有无。

3．恶性测试：浸润性试验，软琼脂培养，异体动物接种，凝集试验等。

以上测试中最主要的为第3项，说明发生转化的细胞是否为恶性转化。

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