球体器官培养侵袭实验

(一)材料

1．待检肿瘤细胞或手术切除肿瘤组织块。

2．鸡胚(9日龄)。

3．培养液

(1)RPMI 1640完全培养液 RPMll640+15％+1％HEPES+青霉素、链霉素各100U／ml。

(2)半固体琼脂培养液取50ml含40％CS的2×RPMI 1640培养液，加等量的加热溶化并保温在45℃水浴中的l％琼脂液，混匀后快速加入24孔培养板中，每孔lml，冷却后即成0．5％半固体琼脂培养液。

4．旋转摇动培养仪、锥形管(5ml、50 ml)、HE染色系列、显微镜等。

(二)方法

1．肿瘤细胞球体的制备

(1)将长满瓶壁的单层细胞经消化、吹打，制成细胞悬液。或将切除的肿瘤组织经剪碎、消化、过筛网等方法制成细胞悬液。

(2)以l000r／min离心5min后再悬浮。

(3)经细胞计数和台盼蓝染色细胞活性检测，活性在95％以上。

(4)调整细胞浓度为(1～5)×10⁵ml。

(5)取6ml悬液置50ml锥形管内，于37℃，5％CO₂、50％O₂和45％N₂的旋转振摇(70r／min)培养仪内培养。72h，可形成规则、完整的肿瘤细胞球体。

(6)选出直径约为O．2mm的球体，用培养液反复洗涤球体表面附着的细胞，备用。

2．靶细胞球体的制备

(1)取9d龄鸡胚心脏，在平皿内剪除大血管和心房部分，留心室。

(2)用Hanks液充分洗涤后，将鸡胚心室切成O．4mm直径的小块，加6ml RPMI 1640完全培养液，移至：50ml锥形管中(每管50～70个)。

(3)于上述条件旋转振摇(120r／min)培养仪内培养24h，选出直径为O．4mm的圆形预培养鸡胚心肌块(precultured heart fragment,PHF)，备用。

3．侵袭实验取O.4mm PHF与0．2mm肿瘤细胞球体各1个，在24 7L培养板的半固体培养液上紧密接触．在37℃、5％CO₂孵箱内培养4～6h．即成为PHF与瘤细胞的球形复合体。

4．将上述成对的复合体移入5ml锥形管中，每管含1个，加1．5ml RPMI 1640完全培养液，于上述条件旋转振摇(120 r／min)培养仪中培养，隔天换液，于不同培养时间取出复合体进行检查。

(三)结果分析

一般在常规组织学及免疫组化染色后进行组织学观察。瘤细胞球体侵袭PHF、的过程大致分4个阶段，按瘤细胞侵袭PHF的广度和深度一般可分为5级，将两者结合起来分析。

第一阶段为瘤细胞向PHF、黏附(O级)：为单纯的PHF，PHF表面由移出的成纤维细胞包绕，其周围形成一层或数层扁平细胞，中心为心肌组织。瘤细胞球体与PHF、仅为接触。

第二阶段为瘤细胞紧密固着于PHF表面(I级)：肿瘤细胞包绕成纤维细胞层，接触部位肿瘤细胞尚未破坏外层细胞。

第三阶段为肿瘤细胞包绕PHF，并穿过PHF外周的成纤维细胞层(Ⅱ级)：肿瘤细胞占据或破坏PHF周围的成纤维细胞层，其边缘凹凸不平，或成团的瘤细胞开始侵入心肌块。

第四阶段为瘤细胞向PHF的深层浸润，最终取代PHF、全组织(Ⅲ级)：肿瘤细胞侵入心肌块内，并取代或破坏心肌组织，其侵袭面积小于50％；(Ⅳ级)：肿瘤细胞大片侵袭心肌，已取代或破坏心肌组织的面积大于50％，心肌细胞有坏死、变性或萎缩。

以上5级中，0、I级为非恶性侵袭；Ⅱ级以上属侵袭性，其中Ⅱ级为低侵袭性．Ⅲ级为中侵袭性，Ⅳ级为高侵袭性。此判断并非绝对，应根据不同瘤细胞的性能来决定。

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