免疫组织化学方法测定P—gp的表达

在肿瘤的治疗中，化疗一直占据着不可替代的地位。联合化疗在大多数恶性肿瘤中收效不大，这其中一个很重要的原因就是肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药性。肿瘤细胞耐药类型较多，一般情况下可分为原药耐药(prlmary drug reslstance,PDR)和多药耐药(mulli—drug resistarice，MDR)。PDR是指肿瘤细胞仅对原药产生耐药；MDR是指肿瘤细胞在化疗过程中对所用的化疗药物产生耐药的同时，对其他结构和功能不同的化疗药物也产生了交叉耐药。多药耐药基因mdrl及其编码的P糖蛋白(P—glycoprotein，P—gP)是目前研究较为深入的ME)R机制，也被认为是MDR产生的最主要机制。这些药物的共同特点是：都具有一C—X—C (C=0或N)的必要结构单元，可能这一结构与P—gp的药物结合位点有关。

一、多药耐药基因IndI、及其表达产物P—gp的检测方法

人mdr₁，小鼠mdr_1a(mdr₃)、mdr_lb(mdr₁)、仓鼠Pgp₁、Pgp₂与MDR相关。mdr₁基因是人体正常细胞具有自我保护作用的基因，在人体正常组织如肾、肾上腺皮质、结肠、肝等均有一定程度的表达，这些组织的肿瘤亦有表达。在未治疗肿瘤中mdr-基因不表达或低表达，而在治疗后复发肿瘤中mdr₁基因高表达的有乳腺癌、卵巢癌、慢性淋巴细胞白血病等。在未治疗肿瘤中mdt．偶尔高表达，在治疗后复发肿瘤中mdr₁基因高表达的有多发性骨髓癌、成神经纤维瘤、非霍奇金淋巴瘤、成年急性淋巴细胞白血病、成年急性粒细脆白血病等。在未治疗肿瘤中即高表达mdr₁基因的有结肠癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、肾上豫直贯癌等。P—gp是mdr₁基因的表达产物。P—gp引起MDR的机制已得到公认：它是一种莲量依赖性药物外流性膜泵，它与抗癌药结合后再与ATP结合，通过ATP供能将细咆内药物逆浓度梯度运出胞外，使细胞内药物浓度不下降而达不到有效杀伤浓度．从而产生耐药性，本节主要介绍免疫组化法、流式细胞术及RT—PCR法检测mdr₁和P—gp的实验．

(一)免疫组织化学方法测定P—gp的表达

1.原理通过某种酶分子标记抗体作为检测试剂，用它与固相支持物上相应抗晕、蔓体或抗原一抗体复合物反应，形成酶抗原一抗体复合物。当加入酶底物后，在复合街上将影童有色沉淀。根据沉淀深浅，可在原位鉴定细胞或组织成分中抗原或抗体的量：常用的有ABC法．

2．材料

(1)标本：待检的肿瘤组织块冰冻切片，或全血、骨髓涂片或体外培养肿瘤细胞离心涂片。

(2)试剂：P—gp免疫组化染色试剂盒。

3．方法

(1)标本自然干燥。

(2)纯丙酮固定30min，自然干燥。

(3)甲醇加H₂O₂至O．3％，室温作用30min，以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次，每次2min。

(4)滴加封闭液，如正常山羊血清室温封闭10min，甩去多余液体，不洗。

(5)滴加抗P—gp单克隆抗体，如JSB一1(1：100)，20～37℃作用1～2h，或4℃冰箱过夜。用O．1mol／LPBS(pH7．2～7．4)洗3次，每次2min。

(6)滴加第二抗体，如生物素化山羊抗小鼠IgG，20～37℃作用20min。用O．1mol／LPBS洗3次，每次2m|n。

(7)滴加亲和素一生物素一过氧化物酶复合物(ABC复合物)，20～37℃作用20min。用0．1mol／L PBS洗4次，每次5min。

(8)二氨基联苯胺(DAB)显色取1ml蒸馏水，加20×DAB浓缩液、20×H₂O₂浓缩液、20×TBS浓缩缓冲液各1滴，混匀后加至切片上。室温显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤。

(9)苏木精轻度复染30s，水洗。

(10)80%、95％、100%乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂胶封片。

4．结果分析光学显微镜观察结果，抗原存在部位呈现棕褐色反应，细胞核为蓝色。大于10%细胞着色为阳性标准。

5．注意事项

(1)每次洗涤后应吸干多余洗液。以免其稀释抗体。

(2)每次实验要设阴、阳性对照，以掌握显色时间。

(3)复染、脱水时间不宜过长。

(4)为了防止造成P—gp抗原的丢失或破坏，标本离体后原则上应立即进行实验操作。用于冰冻切片的组织在离体后应立即包埋、密封，置于液氮或干冰中速冻，低温冰箱保存(可先固定，然后用PBS洗，干燥后置低温冰箱内保存，短时间内使用)。

来源：中国微生物菌种网www.bnbio.com