血清的使用和储存

  只有正确地使用及保存血清，才能使血清发挥应有的作用。

①血清的解冻：血清解冻需采用逐步解冻的方法。一70—一20℃低温冰箱中保存的血清故人4℃冰箱中溶解1 d。然后移入室温，待全部溶解后再分装。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。切勿直接将血清从一20℃进入37℃解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。

②血清的热灭活：血清热灭活是指56℃、30 min加热已完全解冻的血清，使血清中的补体成分灭活。血清中的补体成分对细胞有毒副作用，会导致平滑肌细胞收缩，肥大细胞和血小板释放组胺，增强吞噬作用，促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化。加热过程中须规则摇晃均匀。一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会影响血清的质量。但若血清用于细胞融合，则必须灭活，否则将影响融合率。

③血清的使用浓度：自从有了合成培养基，血清就作为一种添加成分与合成培养基混合使用，使用浓度一般为5％一20％，最常用的是10％。过多地使用血清，容易使培养中的细胞发生变化，特别是一些二倍体的无限细胞系，迅速生长之后易发生恶性转化。

④血清的保存：需要长期保存的血清必须储存于一70—-20℃低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月。由于血清结冰时体积会增加约10％，因此，血清在冻入低温冰箱前，必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。切勿将血清在37℃放置太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中的有效成分会遭到破坏而影响血清质量。

2)血浆

早期的组织培养常将组织块生长于血凝块之中，自从。1907年Hamson首次使用血浆以来，血浆曾被广泛应用。血浆不仅可用于支持培养组织块，而且还供给细胞生长的营养物质，但缺点是易发生液化，目前已很少单独使用。一般使用禽类血浆，最常用的为1岁以下的雄性鸡类，其血钙水平较恒定，激素含量少，且较易采取。采血的方法有3种：翼静脉取血、心脏取血和颈动脉取血。采血时应防止凝血，整个制备过程要特别注意保持无菌。

鸡血浆制备方法：

①干燥注射器先吸取少许肝素，湿润针管内壁(注意肝素过量可以产生细胞毒性)。

②选择年幼的鸡，从其翼静脉采血。

③3 000 r／min离心lO min，取上清液分装，低温冰箱保存。

3)组织浸出液

以前培养组织的培养基中含有的组织浸出液，通常是胚胎浸出液。它的主要成分中所含有的大分子核蛋白和小分子氨基酸有促进细胞生长的作用。近年来组织浸出液已被有效的制品所替代，仅在某些特殊情况下使用。

鸡胚浸出液制备方法：

①选正常受精鸡胚，将其放于37℃的孵箱内孵育，保持空气流通和一定的湿度，每日翻动鸡蛋1次。

②经常用灯观察鸡胚发育状况。如发现血管不清晰等不良状况，应及时去除。

③在10—11 d，用碘酒和乙醇消毒蛋壳。

④用消毒弯头剪剪除气室部蛋壳，剥离气囊膜和尿囊膜，取出鸡胚，将几个鸡胚置于无菌平皿中。

⑤去除鸡胚眼睛，用Hank's液洗去血液及卵黄。

⑥加人等量Hank's液，用匀浆器匀浆。

⑦移至离心管内，室温放置30 min后，3 000 r／min离心30 min，取上清液分装后低温保存。使用前需解冻，然后用2 000 r／min离心10 min，取上清液方可使用。

4)水解乳蛋白

水解乳蛋白是乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，含有丰富的氨基酸，是常用的天然培养基。最先是为培养猴肾细胞设计的，但后来也用于培养其他很多细胞系，包括初代培养细胞等，效果很好。近年来广泛使用的合成培养基已代替了乳白蛋白。但因其成分简单，在培养基不足等特殊情况下也有其应用价值。一般配制成0．5％的溶液，使用时配比为80％’85％乳白蛋白液+15％～20％小牛血清或40％~L白蛋白液+40％合成培养基+15％～20％小牛血清。

水解乳白蛋白为蛋黄色粉末，易潮解结块，但不影响使用。其溶液呈微酸性。不同商品同，在色泽、氨基酸含量和营养价值上可能有一定差异，甚至影响细胞的生长，在更换品种时直进行预实验，以检测质量。

水解乳蛋白配法：

①称量：称0．58 g水解乳蛋白粉入烧杯中，加少许灭菌Hank’s液调成糊状。

②溶解：补加Hank’s液至100 mL，不断搅拌，充分溶解，置室温1～2 h，并不时搅拌。

③过滤：滤纸滤过，分装入瓶中。

④灭菌：445．22 kPa 10 min高压蒸汽灭菌后，4℃冰箱保存。

5)胶原

胶原是细胞生长良好的基质，从动物特定组织中用人工法提取出的，利于组织和细胞的固定，也是天然培养基的一种。胶原主要用于细胞的附着，能改善细胞表面性质，促进细胞生长。胶原可来自大鼠尾腱、鼠真皮、牛真皮、牛眼水晶体等，其中以鼠尾胶原最为常用和制备简便，可配制成0．1％一1％的醋酸溶液。

胶原制法：

①取组织：取体重250 g左右大白鼠1只，从尾根部切断鼠尾，置75％酒精中浸泡30 min；无菌条件下将鼠尾切成1．5cm小段，剔除皮毛，抽出尾腱置平皿中。

②溶解：取1.5 g剪碎尾腱浸入150 mL醋酸溶液(0．01～O．25 M)，置4℃冰箱中，并不时摇动，48 h后，移人灭菌离心管中。

③分离：以4 000 r／min离心30min(最好在4℃条件下)，吸取上清液，10磅10 min高压灭菌后分装入小瓶中，一20℃冰箱保存；残渣可再加40mL醋酸液作用24 h后，取上清液再离心收集。

④使用方法：用吸管吸少许胶原涂于灭菌培养瓶内壁培养面上，不宜太厚，以倾斜瓶时不流动为宜；向培养瓶内通以氨气后封上瓶盖或用浸有氨水的棉球堵塞瓶口(或不用氨气处理，而是置于37℃温箱过夜；或置室温48 h，再用无菌蒸馏水冲洗晾干)，作用30min，待胶原凝固，然后用无菌BSS或基础营养液洗涤胶原面后，再经细胞培养液浸泡过夜，4 ℃备用。生理盐水冲洗、晾干，即可使用。

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