透射电镜细胞样品的制备(一)

  光学显微镜一般采用可见光照明。可见光的波长较长，一般为390～760 nm，这就导致光学显微镜的分辨率较低，一般只能观察大于O．2μm的结构，而O．2μm以下的亚显微结构(submicroscopic structure)或超微结构(ultrastructure)只能通过电子显微镜进行观察。

透射电子显微镜(transmission eletron microscope，TEM)与光学显微镜的成像原理基本相同，只是前者以电子束代替可见光，以电磁透镜代替光学透镜，并使用荧光屏将肉眼不可见的电子束成像。当带电粒子在电场或磁场的作用下会发生偏移，沿光轴呈旋转对称的电磁场，能使从轴上一点发出的电子重新汇聚在中心轴的另一点上。该电磁场对电子显示出透镜的作用，因此被称为电子透镜。电子透镜可以对电子聚焦，使电子流成像。

当由阴极发射的电子，经过高压加速，通过电子透镜聚焦形成快速电子流，投射到很薄的样品上，并与样品中各种原子的核外电子发生碰撞，形成电子散射，若样品结构的密度及厚度越大，元素的原子序数越大，电子的散射越强，这样通过的电子被样品后面小孔经光阑挡住的就越多，像的亮度较暗；若样品结构的密度及厚度越小，电子的散射就越小，穿过光阑的电子束就越强，则成像亮度较大，结果在荧光屏上形成与细胞结构相应的、明暗不同的黑白图像。由于高速运动的电子流其波长远比光波波长短，所以电镜分辨率比光镜高，可达0．1 nm，放大倍率达80万倍。

1)透射电镜的构造

透射电镜主要由电子光学系统、真空系统和供电系统3部分组成。

(1)电子光学系统

电子光学系统是构成电镜的主体，包括电子枪、聚光镜、样品室、物镜、中间镜、投影镜、荧光屏和观察与记录装置。

①电子枪：电子枪是电子光源的发射装置，由阴极、栅极、阳极组成。阴极为钨丝制成的V形灯丝，栅极位于阴极阳极之间，用来控制电子发射的强度，并将阴极发射的电子挤压成直径小于100 μm的束流，即为电镜的光源。阳极可以调节电子波长，阳极电压越高，电子波长越短，电镜的分辨率越高。

②聚光镜：聚光镜的作用是汇聚电子束，控制照明束斑和孔径角的大小，以减少能量的损失，使更多的电子束投射到样品上，并成像放大。一般电镜装置有两个聚光镜。

③样品室：样品室位于聚光镜之下和物镜之上，用于安放载有样品的载网。

④物镜：物镜是短焦距的强磁透镜，它的性能直接影响到电镜的性能。物镜的质量越好，电镜的分辨率越高。

⑤中间镜和投影镜：中间镜和投影镜的结构类似物镜，用于控制总放大率，调节范围比较大，一般调节范围为100倍至几十万倍。投影镜可将中间像放大后在荧屏上成像。

⑥荧光屏和观察与记录装置：观察与记录装置主要由荧光屏和照相底片室组成。需要记录图像时可以开荧光屏，使置于荧光屏下的照相底版曝光成像，再经冲洗，即可得到一张所需照片，以永久保存。

(2)真空系统

包括机械泵、空气过滤器、油扩散泵及排气管道等部件，使镜筒内保持高度真空状态。电镜利用高压电子束为照明源，要求电子束的通道上不能有游离气体存在，以避免与气体分子碰撞引起电离、放电、电子散射、灯丝氧化、污染样品等，影响观察效果或发生故障。

(3)供电系统

供电系统是为透镜装置提供稳定的电源，包括高压系统电源、各透镜的电源及真空泵的电源等。供电系统的稳定性十分重要，直接影响成像的质量。

2)透射电镜在生物研究中的主要技术

(1)常规超薄切片技术

一般透射电镜电子束的穿透能力较弱，大多数标本无法直接在电镜下观察，必须切成厚度为50一70 nm的超薄片，这种制作超薄片的技术称为超薄切片技术。在透射电镜的生物医学样品制备方法中，超薄切片技术是最基本最常用的制备技术，其他一些样品制备技术，如细胞化学技术，免疫电镜技术及电镜放射自显影技术都离不开超薄切片的制作。利用透射电镜观察超薄切片，可以了解细胞的精细结构。

超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。但是，超薄切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、具有强致癌性。

(2)负染色技术

负染色技术也称阴性反差染色，它是由Hall等首先采用的一种染色技术，与超薄切片法相比，该技术具有分辨率高、简单易行和快速方便等优点。因此在生物学研究中广泛应用。这种方法可以显示大分子、细菌、病毒、细胞器及蛋白质晶体等样品的形状、大小和表面结构特征。尤其是在病毒学领域，有关病毒的分类及病毒亚单位结构的显示、病毒与抗体的相互作用等研究中，负染色更是不可缺少的实验技术。

①样品要求：

a．虽然样品悬液的纯度不要求很高，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片、培养基残渣、糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。

b．样品悬液的浓度要适中，样品太稀在电镜下很难找到，样品太浓会堆积影响观察。

②操作流程：

a．吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟。

b．用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1—2 min。

c．滤纸吸去负染色液，晾干。

d．用透射电镜进行观察。

(3)金属投影与复型技术

金属投影技术是利用真空喷镀仪对样品进行投影的一种技术，Williams首先用这种技术来增加电镜图像的反差。该技术还可用来测量颗粒及大分子的大小。复型技术主要用于样品表面结构的研究。某些坚硬的材料，如牙齿、骨骼、金属等，它们是不透明的，并且很难制成超薄切片，对于这些材料可用一种电子透明的薄膜将其表面结构复制下来，即成复型。通过对该复型样品的观察，就可以了解原有样品的天然断面或人工断面的结构特征。

(4)冷冻切片技术和冷冻蚀刻复型技术

冷冻切片技术是使样品迅速冷却，然后用冷冻切片机进行冷冻切片，它省去了普通超薄切片中繁杂的化学固定与包埋操作。该技术在细胞化学研究中有着特殊用途。冷冻蚀刻复型技术是一种冷冻断裂与复型相结合的样品制备技术，该技术在生物学中的广泛应用不仅验证了超薄切片所展示的细胞超微结构，而且还揭示了某些前所未见的新结构，尤其是在显示生物膜的结构方面，该技术有着独特作用。

(5)电镜细胞化学技术

电镜细胞化学技术又称超微结构细胞化学技术，它是从光镜组织化学的基础上发展起来的一种超微结构技术，它的任务是研究细胞内各种成分在超微结构水平上的分布情况以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化，以阐明细胞的化学和生化功能。其中最主要的是蛋白质(尤其是酶的细胞内定位)，其次是核酸、脂肪、碳水化合物及无机离子的定位。该技术有力地促进了形态学和生物化学的结合，使生命科学的研究进入了新的水平。

(6)免疫电镜技术

免疫电镜技术也称为电镜免疫组织(或细胞)化学技术。免疫电镜技术是通过特殊的标记方法使抗体与电子致密的标记物相结合，然后利用电镜在超微结构水平上鉴定抗原一抗体的结合反应。在免疫学领域中，这是一种非常有用的实验技术。

(7)电镜放射自显影技术

电镜放射自显影技术是一种利用放射性同位素作为标记物对细胞化学物质进行超显微结构的定位、定性或定量研究的技术。这种技术不仅用于对重要的代谢物质进行定位、定性或定量，而且还用于显示抗原-抗体的结合，激素或药物与受体的结合，病毒的感染与复制部位等。因此这是一种非常有用的现代生物学技术。

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