免疫酶细胞化学染色技术

免疫酶细胞化学染色技术是将抗原抗体的特异性与酶的高效催化作用相结合的一种免疫标记法。它通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再利用酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，置于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，即用酶标记抗原或抗体，以酶与底物的呈色反应进行抗原或抗体的示踪，对呈色反应后形成的有色化合物进行积分光密度的测定，则可以对免疫阳性产物做半定量的分析。最先采用的是将酶标记在第一抗体上，与组织细胞中的抗原反应，最后加酶底物显色。后来，又发展了抗原．抗体．酶标抗体的方法，不仅增加了酶标抗体的通用性，而且也增加了敏感性。随后，Stemberger等在此基础上发展出非标记抗体酶法。此项技术现在成为最常用的一项免疫组化学实验技术，被广泛应用于医学和生物科学的各个领域。

非标记抗体免疫酶法的特点是所用抗体均为未标记，利用二抗作为桥，将一抗和终抗连接起来，而终抗体为抗酶抗体，来自与一抗相同的动物种属，是将酶免疫动物后得到：由于所用抗体未标记，避免了由于共价结合后造成的对抗体和酶活性的损害，使敏感性增强c目前常用的未标记抗体酶法是将桥抗体与一抗和标记的检测试剂复合物连接起来。后者包括过氧化物酶一抗过氧化物酶复合物(PAP)、双桥PAP、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP)复合物等。

(1)PAP法

该法是由Stemberger建立并加以改良。PAP法的主要特点是提前将过氧化物酶与抗酶抗体制成复合物(PAP)。PAP复合物分子质量约为400-430 kDa，含两个抗体分子和三个酶分子，构成稳定的五角形环状结构，三个角为酶，两个角为抗体。在染色过程中，第一步加一抗，第二步加二抗，第三步加PAP复合物。

(2)双桥PAP法

该法是在PAP法基础上，重复使用第二抗体和PAP复合物，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上，使敏感性增强。因此，对抗原的检测有明显的放大作用。

(3)APAAP法

基本原理与上述PAP法相同，只是提前将碱性磷酸酶和抗碱性磷酸酶抗体复合物(APAAP)作为第三步。

免疫酶细胞化学技术的注意事项有：

①固定液或其他保护液中取出的组织、切片，首先用实验中使用的缓冲液(如PBS、TBS等)充分清洗(3—5次)，每次5 min。

②非免疫的正常血清(最好与第二抗体同种属动物的血清)孵育切片，并且不能清洗，直接进行下面的反应。

③在酶显色反应中应注意避光，并要注意控制时间，如辣根过氧化物酶的显色时间随温度升高而减少。

④在PAP法中，一抗的浓度不能过高，但二抗(桥抗体)需要过量。

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